Efecto de la Leche Fermentada que Contiene Lactobacillus Casei Cepa Shirota en Ancianos con Sarcopenia

1. Inscripción de sujetos La definición de sarcopenia se basa en el algoritmo del Asian Working Group for Sarcopenia (AWGS).

1. Masa muscular: medida utilizando Inbody S10 y estandarizada por altura, mostrada por el índice músculo esquelético [SMI=masa muscular apendicular (kg)/talla (m2)]. La baja masa muscular se definió como:

   • Hombres: SMI <7,0 kg/m2
   • Mujeres: SMI <5,4 kg/m2

2. Fuerza de prensión: medida por dinamómetro electrónico de empuñadura. La baja fuerza de prensión se definió como:

   • Hombres: <28 kg
   • Mujeres: <18 kg

3. Fuerza de las extremidades: medida por Tiempo 5 veces para el método de pararse en una silla. La fuerza baja de las extremidades se definió como:

   • Tiempo para 5 veces de pararse en una silla: ≧12 s La sarcopenia se definió por (1) y uno de (2), o (3)

     2. Intervención del estudio Bebidas de prueba incluidas Fermentación Leche fermentada con L. casei cepa Shirota YIT9029 (LCS) proporcionada por Yakult Company (Taipei, Taiwán). Las bebidas se distribuyeron y almacenaron a temperaturas que oscilaban entre 0 y 10°C. La leche de fermentación contenía LCS en más de 3x10^8 CFU por botella de 100 ml.

Los participantes tomarían 2 botellas al día (104 Kcal/día). La intervención del estudio debe tomarse dos veces al día aproximadamente a la misma hora. Todas las leches se enviarían al participante semanalmente (14 biberones/semana).

3. Evaluación del estudio 3-1 Medición antropométrica y evaluación de la composición corporal Se detectaron datos de medición antropométrica de altura, peso, circunferencia de la cintura, circunferencia de los músculos del brazo, circunferencia de la cadera y circunferencia de la pantorrilla utilizando una cinta métrica y una báscula.

La composición corporal se detectó mediante análisis de impedancia bioeléctrica (BIA) como instrumento de prueba no invasivo.

3-2 BIA Los sujetos se paran en met sin zapatos ni calcetines. Los brazos no tocan la parte del tronco del cuerpo y se extienden naturalmente en un ángulo de 15 grados desde el tronco. Los electrodos de mano están marcados THUMB para el pulgar y MIDDLE para el dedo medio. Los electrodos de los pies deben colocarse entre el tobillo y el talón del examinado. Se suministró corriente eléctrica desde los electrodos en las puntas de los talones de ambos pies y las yemas de los dedos de ambas manos.

3-3 Fuerza muscular La fuerza de prensión medida en condiciones estándar con un modelo bien estudiado de un dinamómetro de mano con poblaciones de referencia puede ser un sustituto confiable para medidas más complicadas de fuerza muscular en la parte inferior de los brazos o las piernas. La medición utiliza un dinamómetro de empuñadura electrónico. La fuerza de prensión baja se define en Hombres: <28 kg; Mujeres: <18kg. Fuerza de las extremidades medida por Tiempo 5 veces para pararse en una silla. Los sujetos se sentaron y se pusieron de pie cinco veces y calcularon el tiempo con un cronómetro. La fuerza de las extremidades inferiores se define en el tiempo para Tiempo de 5 veces para pararse en una silla: ≧12 s.

3-4 Rendimiento físico El rendimiento físico se evaluó utilizando la velocidad de marcha habitual de 6 metros, TUG y SPPB.

3-5 Velocidad de la marcha Se instruyó a los participantes para que caminaran desde parados a un ritmo normal y cómodo para ellos o para que caminaran tan rápido como pudieran hasta que llegaran al final del camino marcado. Un examinador capacitado caminó detrás del participante y detuvo el cronometraje cuando el pie del participante tocó el piso al final del recorrido de caminata. A los participantes se les proporcionaron descansos según fuera necesario durante la sesión de prueba. El rendimiento físico bajo se define < 1 m/s.

3-6 TUG Se instruyó a los participantes para que se levantaran de la silla, caminaran 3 metros hacia adelante y regresaran para sentarse en la silla. El rendimiento físico bajo se define ≧ 20 s.

3-7 SPPB Los participantes fueron seguidos hasta SPPB para realizar la prueba. Se define rendimiento físico bajo ≦ 9 puntuaciones.

3-8 Recuento total de bacterias, composición de la microbiota intestinal y análisis de metabolitos derivados de la microbiota

3-8-1 Secuenciación de 16S V1-V2 El ADN del genoma total de las muestras se extrajo de muestras de heces mediante el método CTAB/SDS. Las regiones V1-V2 del gen 16S rRNA se seleccionaron para análisis de pirosecuenciación.

3-8-2 Análisis de la secuencia del gen del ARNr 16S Los datos de la secuencia del gen del ARNr 16S se procesaron con QIIME v 1.8.0 utilizando los parámetros predeterminados. Las secuencias se agruparon en unidades taxonómicas operativas (OTU) con una similitud del 97% y luego se les asignó la taxonomía de Greengenes utilizando el clasificador de taxonomía de consenso uclust.

3-8-3 Ácidos grasos de cadena corta fecales Las muestras fecales se diluyeron en agua desionizada y se homogeneizaron. Para el análisis de ácidos grasos de cadena corta (SCFA), se utilizó un sobrenadante. La extracción con éter dietílico se llevó a cabo utilizando el método de Adorno et al.

3-8-4 Determinación de IPA y TMAO Los investigadores analizaron los niveles séricos y fecales de IPA mediante LC-MS/MS (4000 QTRAP, ciudad, estado, EE. UU.).

Las concentraciones de TMAO en plasma se detectaron mediante espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida de dilución de isótopos estables (DLM4779-1, Andover, MA, EE. UU.) (Ke et al., 2018).

3-8-5 Recuento bacteriano total por qPCR Los recuentos bacterianos totales se determinaron mediante análisis qPCR de acuerdo con el método descrito por Shima et al. (Beneficial Microbes, 2019) utilizando conjuntos de cebadores directos (UniF: GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA) y cebadores inversos (UniR: ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC). Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768T se utilizó como cepa estándar.

3-9 Análisis bioquímicos de sangre

3-9-1 Muestreo de sangre Se recolectaron muestras de sangre de los sujetos antes y después de la prueba. Las muestras de sangre se colocaron en tubos de recolección que contenían anticoagulante EDTA y heparina.

3-9-2 Parámetros metabólicos Todas las mediciones metabólicas se realizaron un día antes del inicio de la intervención y al final de la intervención. CBC, TSH, T4 libre, Vit-D, colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicéridos, glucosa en ayunas, insulina en ayunas, urea en sangre, nitrógeno, prealbúmina plasmática, albúmina, ALT, AST, HbA1c, HS-CRP, osteocalcina, adiponectina, leptina, serotonina y creatinina se midieron después de un ayuno de al menos 8 horas.

3-9-3 Análisis de aminoácidos plasmáticos Los investigadores utilizaron un analizador de aminoácidos Hitachi L-8900 (ubicación) para detectar y cuantificar alanina, fenilalanina, cisteína, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, leucina, isoleucina , lisina, prolina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, tirosina y metionina en las muestras de plasma.

3-9-4 Análisis de citoquinas inflamatorias Las citoquinas séricas asociadas con la inflamación TNF-α, TGF-β, IL-6, IL-17 e IL-10 se analizaron usando kits colorimétricos (Elabscience, China). Los procedimientos siguieron las instrucciones del kit y se midieron usando un lector ELISA (Bio Tek, PowerWave XS2, City, State, USA).

3-9-5 Análisis de marcadores antioxidantes Muchas enzimas antioxidantes en el cuerpo humano, como superóxido dismutasa (SOD) (Elabscience, China), glutatión peroxidasa (GPx) (biovision, ciudad, estado, EE. UU.) y catalasa (CAT ) (biovision, Ciudad, Estado, USA). Se evaluó la actividad de las enzimas en el suero mediante el kit ELISA. Los procedimientos siguieron las instrucciones del kit y fueron medidos por el lector ELISA (Bio Tek, PowerWave XS2, City, State, USA).

3-9-6 Elementos traza Aproximadamente 1 ml de cada muestra de sangre completa se digirió en microondas con 3 ml de ácido nítrico al 65 % (reactivo ultrapuro, J.T. Baker). Posteriormente, los investigadores lavaron los residuos en tubos de microondas con ácido nítrico al 2 % y luego filtraron los fluidos digeridos con un filtro de 0,22 μm. Las soluciones filtradas totales se almacenaron en tubos de centrífuga de 15 mL. Los niveles de Pb, Cd, As, Hg, Mn, Al, Tl, V, Na, K, Mg, Ca, Fe, Zn, Se se determinaron mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS; Agilent 7800).

3-9-7 Análisis de la función inmunitaria En las células T que se infiltran en el músculo esquelético, las células T reguladoras (Treg) son un subconjunto importante. Tregs puede regular la inflamación en el músculo y promover la regeneración del músculo; sin embargo, el efecto catabólico de la inflamación fue promovido por las Treg disfuncionales en el músculo envejecido. [EbioMedicine. 2019 noviembre; 49: 381-388.] Los glóbulos se tiñeron con anticuerpos monoclonales (anti-CD4, -CD25 y -FoxP3) y se analizaron por citometría de flujo.