基于组学的 NAFLD/潜在 NASH 预测因子

旨在为埃及 HCV 感染患者提供治愈方法的国家治疗计划是埃及人群中无 HCV 和健康肝脏的火花。 然而，另一种快速发展的肝病正在出现，死亡率和发病率都在增加，全球患病率估计为 25-35%；非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。 NAFLD 的最高发生率来自中东 (32%)。 NAFLD 在普通人群中的患病率随着年龄的增长而增加；儿童为 3%，青少年为 5%，20 至 40 岁为 18%，40 至 50 岁为 39%，70 岁以上则超过 40%。

NAFLD 是一种代谢性疾病，其范围从单纯性脂肪变性发展为非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 和肝纤维化，可能导致肝硬化、肝细胞癌和肝功能衰竭。 因此，NASH 被认为是 NAFLD 的一种严重形式。 鉴于 NAFLD 与肥胖、2 型糖尿病、久坐不动的生活方式、血脂异常和不健康饮食模式等全球流行病之间的关联，预计 NAFLD 的患病率将会增加。 因此，NAFLD 是世界医疗保健系统的主要临床和经济负担。

尽管肝活检是评估与 NASH 相关的纤维化的参考标准，但侵入性操作的固有局限性和重复取样的需要导致开发了几种非侵入性检测 (NIT) 作为肝活检的替代方法. 目前的 NITs 用于诊断 NAFLD 患者的晚期纤维化 (5)，此类 NITs 主要包括生物学（血清生物标志物算法）或物理（组织硬度的影像学评估）评估。 然而，目前可用的 NIT 有一些局限性，例如可变性、准确性不足和错误的风险因素。 当前的 NIT 不仅用于诊断慢性丙型肝炎的显着纤维化，还用于诊断 NAFLD/NASH 患者的晚期纤维化。

在资源匮乏的国家，尽管 NAFLD 患病率很高，而且其早期阶段可以通过改变饮食和生活方式来逆转，但 NITs 的可用性可能有限，尤其是更昂贵的基于成像的测试。 因此，基于血液的生物标志物很有吸引力，但迄今为止可用的生物标志物只有中等的诊断准确性。 此外，只有少数 NAFLD 病例得到诊断和正确治疗，因为缺乏非侵入性可靠且经过验证的早期诊断方法阻碍了早期阶段的检测。 此外，可用于管理 NASH 的选项很少，并且目前没有 FDA 批准的 NAFLD 疗法。

迄今为止，NAFLD的发病机制尚未完全阐明。 NAFLD 被认为与饮食、遗传易感性和肠道微生物群之间复杂的相互作用有关 (6)。 与此同时，肠道菌群和微生物代谢产物在NAFLD中的作用也引起了更多的关注。 肠道微生物群在肠-肝轴的基础上调节 NAFLD 的发生和发展。 因此，需要基于致病途径的未来靶向治疗策略，以开发针对 NASH 患者的有效治疗方法。

从广义上讲，与以高通量方式测量生物分子相关的科学领域称为“组学”。 尽管如此，基因组学、蛋白质组学和代谢组学等组学技术的不断进步为发现有用的非侵入性生物标志物和增加对 NAFLD 和 NASH 诊断、预后和药物反应的病理生理学理解带来了巨大希望。 大多数人应用了一种组学技术。 基于对 NASH 发展的遗传和环境风险因素之间相互作用的更好理解，人类遗传学的进步为解决 NASH 治疗的迫切需求提供了新的机会。 据报道，微小 RNA（miRNA）通过靶向参与脂质代谢的基因和与 NAFLD 发病机制相关的促炎因子与 NAFLD 密切相关。 此外，鉴于大多数血清糖蛋白是在肝脏中合成的，许多糖蛋白与肝脏疾病的诊断有关。 不幸的是，一些开创性的研究已经成功地应用多组学技术来研究 NAFLD/NASH，但没有一项是在埃及人群中进行的。

与通常关注单一方面的传统标志物相比，研究人员旨在开发一种多组学复合预测生物标志物组，用作埃及评分系统，以提高 NAFLD 诊断的预测能力并限制其进展为 NASH的疾病。 这种预测性生物标志物还可以有益于 NAFLD 的临床管理，以限制其进展为 NASH。

具体的目标：

1. 使用下一代测序 (NGS) 在参与者子样本（30 名患者）中识别导致血脂异常的功能变异及其致病基因突变。
2. 鉴定和验证埃及人群中最重要的 10 个基因（之前在全基因组分析中鉴定为与 NAFLD/NASH 相关）：PNPLA3 rs738409、PNPLA3 rs6006460、FDFT1 rs2645424、COL13A1 rs1227756、NCAN rs2228603、LYPLAL1 rs121370458、GCK , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 和 MTTP rs1800591 使用 TaqMan SNP 基因分型分析
3. 概述遗传变异与目前使用的伴有和不伴有纤维化的 NAFLD 治疗方法的可能关联（例如维生素 E、维生素 C、维生素 D；儿童二甲双胍和成人吡格列酮……）
4. 根据研究组，通过 PCR 阵列鉴定血浆 miRNA 的表达水平（血浆 miRNA 的 168 组基因中的前 5 位）
5. 评估与目前使用的治疗不伴或伴纤维化的 NAFLD 的药物相关的 miRNA 表达谱改变的可能性。
6. 确定 N- 和 O- 糖蛋白的糖基化谱，这些糖蛋白被证明与 NAFLD / NASH（转铁蛋白，载脂蛋白 C III（apoC III），触珠蛋白，Mac2 结合蛋白，IgG）-）在患有 NAFLD 的埃及患者中没有或有纤维化
7. 评估所研究糖蛋白的糖基化模式与目前使用的有和无纤维化治疗 NAFLD 的药物之间的关系。
8. 使用用于 16S rRNA 基因扩增子文库制备和测序的快速 RT-PCR 测试，鉴定埃及人群中与无纤维化和有纤维化的 NAFLD 患者以及对照（10 个细菌分离株）相关的细菌分离株
9. 通过使用气相色谱-质谱仪 (GC-MS) 分析比较无纤维化和有纤维化的 NAFLD 和对照的浓度，确定前五种唾液检测到的微生物组相关代谢物
10. 使用商业 ELISA 试剂盒评估一些已知的元基因组功能的关联。 （乳铁蛋白、脂多糖和免疫球蛋白 A 的唾液浓度，用于检测无纤维化和有纤维化的 NAFLD。
11. 确定检测到的唾液代谢物的组合是否可以用作检测无纤维化和有纤维化的 NAFLD 的生物标志物特征。
12. 确定流行病学、饮食、生活方式对所研究的多组学生物标志物以及不伴有和伴有纤维化的 NAFLD 临床表现的相互作用和影响。

研究方法和工具

这项研究是一项横断面探索性研究，使用了 24 个月的工具：

1. 基线评估问卷：

   1.1 社会人口学特征评估、详细病史采集和其他已知风险因素（口腔卫生……）， 最多三代的家族谱系构建，以诊断 NAFLD 和 NASH 的遗传和家族原因风险 1.2 营养和饮食行为评估，使用饮食质量指数评估问卷、饮料摄入量进行人体测量

2. 本研究将研究血液和活体中的多组学生物标志物。 该方法基于检测新的分子发病机制和新基因，以发现所研究的多组学标记的埃及相关生物标记。

   2.1 血样：基因组学

   2.1.1.1 检测与血脂异常有关的基因：使用血脂异常主要基因的下一代测序 (NGS) 面板鉴定导致血脂异常的功能变体； (LDLR)、(APOB)、(PCSK9) 和 (LDLRAP)。 这种技术可以帮助我们识别新的与血脂异常相关的变体以及与埃及人群普遍相关的变体。 这将适用于 30 名仅被诊断患有血脂异常的参与者。

   2.1.1.2 通过“TaqMan SNP 基因分型分析”检测 NAFLD 和 NASH 的基因多态性，检测先前在全基因组分析中确定与 NAFLD/NASH 相关的整个基因组（待在埃及人群中验证）PNPLA3 rs738409、PNPLA3 rs6006460、FDFT1 rs2645424 , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 和 MTTP rs1800591：来自所有参与者

   • 使用美国 Qiagen 提供的 DNA 提取试剂盒使用 Nanodropper 2000 (ThermoScientific) 从外周血中提取 DNA。
   • SNP 基因分型将使用 Roche 实时 PCR 系统（light cycler 480）和 TaqMan 等位基因鉴别分析（Applied Biosystems，USA）进行。

   2.1.2 血浆 microRNA 的表观基因组学表达谱

   • 前 5 个 miRNA 的表达分析：将选择前 5 个改变的 miRNA，使用汞 LNA SYBR Green PCR 试剂盒（Qiagen）通过实时 PCR 在所有患者和对照中进行分析。 使用 2-ΔCt 方法计算 miRNA 的倍数变化。

   2.1.3 糖蛋白组学：识别糖基化模式转铁蛋白、载脂蛋白 C III (apoC III)、触珠蛋白、Mac2 结合蛋白、IgG（美国圣克鲁斯）。 吨

   2.2 唾液样本： 2.2.1 唾液代谢组学 2.2.2 使用气相色谱-质谱仪 (GC-MS) 进行代谢物鉴定 分析：评估前五种已鉴定的微生物相关代谢物的浓度（至少 85%样本）作为所有参与者的代谢组学生物标志物，将使用 GC-MS 分析进行调查。

   2.2.3 一些已知的元基因组功能的预测分析。 将为所有参与者确定乳铁蛋白、脂多糖 (LPS) 和免疫球蛋白 A (IgA) 的唾液浓度。

3. 通过个别咨询改变行为