Предикторы НАЖБП/потенциального НАСГ на основе омиксов

Национальная программа лечения, направленная на излечение египетских пациентов, инфицированных ВГС, стала проблеском света на пути к избавлению от ВГС и здоровой печени среди египетского населения. Тем не менее, появилось другое быстро развивающееся заболевание печени с увеличением как смертности, так и заболеваемости, и предполагаемая распространенность составляет 25-35% по всему миру; неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП). Самый высокий уровень НАЖБП зарегистрирован на Ближнем Востоке (32%). Распространенность НАЖБП среди населения в целом увеличивается с возрастом; от 3% у детей, 5% у подростков, 18% в возрасте от 20 до 40 лет, 39% в возрасте от 40 до 50 лет и до более чем 40% в возрасте старше 70 лет.

НАЖБП представляет собой нарушение обмена веществ, спектр которого прогрессирует от простого стеатоза до неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) и фиброза печени, потенциально приводя к циррозу, гепатоцеллюлярной карциноме и печеночной недостаточности. Соответственно, НАСГ считается тяжелой формой НАЖБП. Учитывая связь между НАЖБП и растущими глобальными эпидемиями ожирения, диабета 2 типа, малоподвижного образа жизни, дислипидемии и нездорового питания, ожидается, что распространенность НАЖБП будет увеличиваться. Таким образом, НАЖБП является серьезным клиническим и экономическим бременем для мировых систем здравоохранения.

Хотя биопсия печени является эталонным стандартом для оценки фиброза, связанного с НАСГ, врожденные ограничения инвазивной процедуры и необходимость повторного взятия образцов привели к разработке нескольких неинвазивных тестов (НИТ) в качестве альтернативы биопсии печени. . Текущие НИТ использовались для диагностики выраженного фиброза у пациентов с НАЖБП (5). Такие НИТ в основном включают биологические (алгоритмы биомаркеров сыворотки) или физические (визуализирующая оценка жесткости тканей) оценки. Однако доступные в настоящее время NIT имеют несколько ограничений, таких как изменчивость, недостаточная точность и факторы риска ошибки. Текущие НИТ использовались не только для диагностики значительного фиброза при хроническом гепатите С, но и для диагностики выраженного фиброза у пациентов с НАЖБП/НАСГ.

В странах с низким уровнем ресурсов, несмотря на высокую распространенность НАЖБП и то, что ее ранние стадии обратимы при изменении диеты и образа жизни, доступность НИТ, вероятно, будет ограничена, особенно более дорогие тесты на основе визуализации. Таким образом, биомаркеры на основе крови привлекательны, но те, которые доступны на сегодняшний день, имеют лишь умеренную диагностическую точность. Кроме того, только меньшинство случаев НАЖБП диагностируется и правильно лечится, поскольку обнаружению ранних стадий препятствует отсутствие неинвазивных надежных и проверенных методов ранней диагностики. Кроме того, существует несколько вариантов лечения НАСГ и нет текущих одобренных FDA методов лечения НАЖБП.

На сегодняшний день патогенез НАЖБП до конца не выяснен. Считается, что НАЖБП участвует в сложных взаимодействиях между диетой, генетической предрасположенностью и микробиотой кишечника (6). В то же время большее внимание привлекает роль кишечной микробиоты и микробных метаболитов при НАЖБП. Микробиота кишечника регулирует развитие и прогрессирование НАЖБП на основе оси кишечник-печень. Соответственно, для разработки эффективного лечения пациентов с НАСГ необходимы будущие целевые стратегии лечения, основанные на патогенных путях.

Вообще говоря, научные области, связанные с высокопроизводительным измерением биологических молекул, называются «омикой». Тем не менее, продолжающиеся технологические достижения в омических технологиях, таких как геномика, протеомика и метаболомика, открывают большие перспективы для открытия полезных неинвазивных биомаркеров и углубления патофизиологического понимания диагностики, прогноза и ответа на лекарства НАЖБП и НАСГ. Большинство применяли одну технику омикс. Достижения в области генетики человека открывают новые возможности для удовлетворения насущной потребности в терапии НАСГ, основанные на улучшенном понимании взаимодействия между генетическими и экологическими факторами риска развития НАСГ. Сообщалось, что микроРНК (миРНК тесно связаны с НАЖБП путем нацеливания на гены, участвующие в метаболизме липидов и провоспалительных факторах, которые связаны с патогенезом НАЖБП. Кроме того, многие гликопротеины связаны с диагностикой заболеваний печени, учитывая, что большинство гликопротеинов сыворотки синтезируются в печени. К сожалению, несколько новаторских исследований успешно применили мультиомные технологии для изучения НАЖБП/НАСГ, ни одно из которых не проводилось среди населения Египта.

Исследователи стремились разработать составную панель прогностических биомаркеров с несколькими омиксами, которая будет использоваться в качестве египетской системы подсчета очков для улучшения прогностической способности диагноза НАЖБП и ограничения его прогрессирования в НАСГ по сравнению с традиционными маркерами, которые обычно фокусируются на одном аспекте. болезни. Такие прогностические биомаркеры также могут помочь в клиническом ведении НАЖБП, чтобы ограничить ее прогрессирование до НАСГ.

Конкретные цели:

1. Выявить функциональные варианты, вызывающие дислипидемию, и мутацию вызывающих ее генов на подвыборке участников (30 пациентов) с использованием секвенирования следующего поколения (NGS).
2. Выявить и проверить 10 наиболее значимых генов (ранее идентифицированных как связанные с НАЖБП/НАСГ в полногеномном анализе) среди населения Египта: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPL07CKR1 rs1813785, , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 и MTTP rs1800591 с использованием анализа генотипирования TaqMan SNP
3. Обрисовать возможную связь генетических вариаций с используемым в настоящее время лечением НАЖБП с фиброзом и без него (например, витамин Е, витамин С, витамин D; метформин для детей и пиоглитазон для взрослых…)
4. Определить уровень экспрессии микроРНК плазмы (5 верхних из 168-панельных генов микроРНК плазмы) с помощью массива ПЦР в соответствии с изучаемыми группами.
5. Оценить потенциал измененного профиля экспрессии микроРНК, связанного с используемым в настоящее время препаратом для лечения НАЖБП без фиброза или с фиброзом.
6. Для определения профиля гликозилирования как N-, так и O-гликопротеинов, которые оказались связанными с НАЖБП/НАСГ (трансферрин, аполипопротеин C III (apoC III), гаптоглобин, Mac2-связывающий белок, IgG) -) среди египетских пациентов с НАЖБП без или с фиброз
7. Оценить взаимосвязь между характером гликозилирования исследуемых гликопротеинов в ответ на применяемый в настоящее время препарат для лечения НАЖБП С ФИБРОЗОМ И БЕЗ ФИБРОЗА.
8. Идентифицировать бактериальные изоляты среди египетских популяций, которые связаны с пациентами с НАЖБП без фиброза и с фиброзом, и с контрольной группой (из 10 бактериальных изолятов) с использованием экспресс-теста RT-PCR для подготовки и секвенирования библиотеки ампликонов гена 16S рРНК.
9. Определить пять наиболее часто обнаруживаемых в слюне метаболитов, связанных с микробиомом, путем сравнения их концентраций при НАЖБП без фиброза и с фиброзом и контролем с использованием анализа газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС).
10. Оценить связь некоторых известных метагеномных функций с использованием коммерческих наборов ELISA. (концентрации лактоферрина, липополисахарида и иммуноглобулина А в слюне для выявления НАЖБП без и с фиброзом.
11. Определить, можно ли использовать комбинации обнаруженных метаболитов слюны в качестве сигнатуры биомаркеров для выявления НАЖБП без фиброза и с фиброзом.
12. Выявить взаимодействие и влияние эпидемиологических, диетических, образа жизни на изучаемые мультиомные биомаркеры и на клиническую картину НАЖБП без и с фиброзом.

Методология и инструменты исследования

Это исследование представляет собой поперечное предварительное исследование, проведенное с использованием 24-месячных инструментов:

1. Анкета для базовой оценки:

   1.1 Оценка социально-демографических характеристик, подробный сбор анамнеза и другие известные факторы риска (гигиена полости рта….), построение семейной родословной до трех поколений для диагностики риска генетических и семейных причин НАЖБП и НАСГ

2. В этом исследовании будут исследованы мультиомные биомаркеры в крови и живых организмах. Подход основан на обнаружении новых молекулярных патогенов и новых генов для обнаружения египетских биомаркеров изучаемых мультиомных маркеров.

   2.1 Образцы крови: геномика

   2.1.1.1 Обнаружение генов, участвующих в дислипидемии: идентификация функционального варианта(ов), ответственного за дислипидемию, с использованием панелей секвенирования следующего поколения (NGS) основных генов дислипидемии; (LDLR), (APOB), (PCSK9) и (LDLRAP). Этот метод может помочь нам идентифицировать новые варианты, связанные с дислипидемией, и те, которые обычно связаны с египетской популяцией. Это будет применяться к 30 участникам, у которых диагностирована только дислипидемия.

   2.1.1.2 Обнаружение полиморфизма генов для НАЖБП и НАСГ с помощью «TaqMan SNP Genotyping Assay» для всего генома, ранее идентифицированного в полногеномном анализе как связанного с НАЖБП/НАСГ (подлежит проверке среди населения Египта) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424 , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 и MTTP rs1800591: от всех участников

   • ДНК будет извлечена из периферической крови с использованием набора для выделения ДНК, поставляемого Qiagen, США, с использованием Nanodropper 2000 (ThermoScientific).
   • Генотипирование SNP будет проводиться с использованием системы ПЦР в реальном времени Roche (световой циклер 480) с анализом аллельной дискриминации TaqMan (Applied Biosystems, США).

   2.1.2 Эпигеномика Профилирование экспрессии микроРНК плазмы

   • Анализ экспрессии первых 5 миРНК: 5 основных измененных миРНК будут выбраны для анализа у всех пациентов и контрольной группы с помощью ПЦР в реальном времени с использованием ртутного LNA SYBR Green PCR Kit (Qiagen). Изменение кратности микроРНК будет рассчитано с использованием метода 2-∆Ct.

   2.1.3 Гликопротеомика: определение характера гликозилирования трансферрина, аполипопротеина С III (апоС III), гаптоглобина, Mac2-связывающего белка, IgG (Санта-Круз, США). Т

   2.2 Образцы слюны: 2.2.1 Метаболомика слюны. 2.2.2 Идентификация метаболитов с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС). образцы) в качестве метаболических биомаркеров среди всех участников будут исследованы с использованием анализа ГХ-МС.

   2.2.3 Прогнозный анализ некоторых известных метагеномных функций. Концентрация лактоферрина, липополисахарида (LPS) и иммуноглобулина A (IgA) в слюне будет определена для всех участников.

3. Коррекция поведения через индивидуальное консультирование