NAFLD/潜在的なNASHのオミクスベースの予測因子

エジプトの HCV 感染患者に治療法を提供することを目的とした国家治療プログラムは、エジプト国民の間で HCV のない健康な肝臓への火花となりました。 しかし、急速に進行している別の肝疾患が出現しており、死亡率と罹患率の両方が増加しており、世界中で 25 ～ 35% の有病率が推定されています。非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）。 NAFLD の発生率が最も高いのは中東から報告されています (32%)。 一般集団におけるNAFLDの有病率は年齢とともに増加します。子供の 3%、10 代の 5%、20 ～ 40 歳の 18%、40 ～ 50 歳の 39%、70 歳以上の 40% 以上です。

NAFLD は、単純な脂肪症から非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) および肝線維症へと進行する代謝障害であり、肝硬変、肝細胞癌、および肝不全につながる可能性があります。 したがって、NASH は NAFLD の重症型と見なされます。 NAFLD と、肥満、2 型糖尿病、座りっぱなしのライフスタイル、脂質異常症、不健康な食事パターンの世界的な蔓延との関連を考えると、NAFLD の有病率は増加すると予想されます。 したがって、NAFLD は、世界の医療システムに対する主要な臨床的および経済的負担となっています。

肝生検は、NASH に関連する線維症の評価の参照基準ですが、侵襲的処置の固有の制限と繰り返しサンプリングの必要性により、肝生検の代替としていくつかの非侵襲的検査 (NIT) が開発されました。 . 現在の NIT は、NAFLD 患者の進行性線維症の診断に使用されていました (5)。このような NIT には、主に生物学的 (血清バイオマーカー アルゴリズム) または物理的 (組織剛性の画像評価) 評価が含まれます。 ただし、現在利用可能な NIT には、変動性、不十分な精度、エラーのリスク要因など、いくつかの制限があります。 現在の NIT は、慢性 C 型肝炎の重大な線維症の診断だけでなく、NAFLD/NASH 患者の進行した線維症の診断にも使用されていました。

低資源国では、NAFLD の有病率が高く、その初期段階は食事やライフスタイルの変更で元に戻すことができるにもかかわらず、NIT の利用可能性は限られている可能性が高く、特に高価な画像ベースの検査がそうです。 したがって、血液ベースのバイオマーカーは魅力的ですが、現在利用可能なものは中程度の診断精度しかありません. さらに、初期段階の検出は、非侵襲的で信頼できる検証済みの初期診断方法がないために妨げられているため、診断され、正しく治療される NAFLD 症例はごく少数です。 さらに、NASH の管理に利用できるオプションはほとんどなく、NAFLD に対して現在 FDA が承認した治療法はありません。

今日まで、NAFLD の病因は完全には解明されていません。 NAFLD は、食事、遺伝的感受性、および腸内微生物叢の間の複雑な相互作用に関与していると考えられています (6)。 同時に、NAFLD における腸内微生物叢と微生物代謝産物の役割が注目を集めています。 腸内細菌叢は、腸 - 肝臓軸に基づいて NAFLD の発生と進行を調節します。 したがって、NASH患者の効果的な治療法を開発するには、病原性経路に基づく将来の標的治療戦略が必要です。

広く言えば、生体分子をハイスループットに計測する科学分野を「オミクス」と呼んでいます。 ただし、ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなどのオミクス技術における現在進行中の技術的進歩は、有用な非侵襲的バイオマーカーの発見と、NAFLD および NASH の診断、予後、および薬物反応の病態生理学的理解の向上に大きな期待を寄せています。 大多数は 1 つのオミクス技術を適用しました。 ヒト遺伝学の進歩は、NASH の発症に対する遺伝的危険因子と環境的危険因子との間の相互作用に関する理解の向上に基づいて、NASH 治療の緊急の必要性に対処する新たな機会を提供します。 マイクロRNA（miRNAは、NAFLDの病因に関連する脂質代謝および炎症誘発性因子に関与する遺伝子を標的とすることにより、NAFLDと密接に関連していることが報告されています. さらに、血清糖タンパク質の大部分が肝臓で合成されることを考えると、多くの糖タンパク質が肝疾患の診断に関連しています。 残念ながら、いくつかの先駆的な研究では、マルチオミクス技術を適用して NAFLD/NASH を調査することに成功しましたが、いずれもエジプト人では行われませんでした。

研究者らは、通常単一の側面に焦点を当てている従来のマーカーと比較して、NAFLD の診断の予測力を向上させ、NASH への進行を制限するためのエジプトのスコアリング システムとして使用されるマルチオミクス複合予測バイオマーカー パネルの開発を目指しました。病気の。 このような予測バイオマーカーは、NAFLD の臨床管理にも役立ち、NASH への進行を抑えることができます。

具体的な目的:

1. 次世代シーケンシング (NGS) を使用して、参加者 (30 人の患者) のサブサンプルで脂質異常症とその原因遺伝子変異を引き起こす機能的バリアントを特定します。
2. エジプト人集団の中で最も重要な 10 個の遺伝子 (ゲノム全体の分析で NAFLD/NASH に関連することが以前に特定された) を特定して検証するには: 、PPP1R3B rs4240624、PPAR rs1800234、および MTTP rs1800591 (TaqMan SNP ジェノタイピング アッセイを使用)
3. 遺伝的変異と、線維症の有無にかかわらず現在使用されているNAFLDの治療との関連の可能性を概説する（例：ビタミンE、ビタミンc、ビタミンD、子供の場合はメトホルミン、成人の場合はピオグリタゾン…）
4. 研究グループに従って、PCRアレイによって血漿miRNA（血漿miRNAの168パネル遺伝子の上位5つ）の発現レベルを特定する
5. 線維症の有無にかかわらず NAFLD の治療に現在使用されている薬物に関連する miRNAs 発現プロファイルの変化の可能性を評価すること。
6. NAFLD/NASH (トランスフェリン、アポリポタンパク質 C III (apoC III)、ハプトグロビン、Mac2 結合タンパク質、IgG) との関連性が証明された N 糖タンパク質と O 糖タンパク質の両方のグリコシル化プロファイルを特定すること。線維症
7. 線維症治療を伴う場合と伴わない場合のNAFLDに現在使用されている薬物に応答して、研究された糖タンパク質のグリコシル化パターン間の関係を評価すること。
8. 16S rRNA遺伝子アンプリコンライブラリーの調製と配列決定のためのラピッドRT-PCRテストを使用して、線維症の有無にかかわらずNAFLD患者とコントロール（10の細菌分離株のうち）に関連するエジプトの集団の中から細菌分離株を特定する
9. ガスクロマトグラフィー-質量分析計 (GC-MS) 分析を使用して、線維症およびコントロールの有無にかかわらず NAFLD の濃度を比較することにより、唾液検出された上位 5 つのマイクロバイオーム関連代謝産物を特定する
10. 市販の ELISA キットを使用して、いくつかの既知のメタゲノム機能の関連性を評価します。 （線維症の有無にかかわらずNAFLDを検出するためのラクトフェリン、リポ多糖、および免疫グロブリンAの唾液濃度。
11. 検出された唾液代謝産物の組み合わせが、線維症の有無にかかわらず NAFLD を検出するためのバイオマーカー シグネチャとして使用できるかどうかを判断する。
12. 研究対象のマルチオミクス バイオマーカーと、線維症の有無にかかわらず NAFLD の臨床症状に対する疫学的、食事、ライフスタイルの相互作用と影響を特定すること。

調査方法とツール

この研究は、24 か月のツールに沿って実施された横断的な探索的研究です。

1. ベースライン評価アンケート:

   1.1 社会人口学的特徴の評価、詳細な病歴聴取、およびその他の既知の危険因子 (口腔衛生….)、 NAFLD および NASH の遺伝的および家族的原因のリスクを診断するための 3 世代までの家系図の構築

2. この研究では、血液中および生体中のマルチオミクスバイオマーカーが調査されます。 このアプローチは、研究対象のマルチオミクス マーカーのエジプト関連バイオ マーカーを発見するための新しい分子病因と新しい遺伝子の検出に基づいています。

   2.1 血液サンプル: ゲノミクス

   2.1.1.1 脂質異常症に関与する遺伝子の検出: 脂質異常症の主な遺伝子の次世代シーケンシング (NGS) パネルを使用して、脂質異常症の原因となる機能的バリアントを特定します。 (LDLR)、(APOB)、(PCSK9)、および (LDLRAP)。 この手法は、脂質異常症に関連する新しいバリアントと、エジプトの人口に一般的に関連するバリアントを特定するのに役立ちます。 これは、脂質異常症と診断された 30 人の参加者のみに適用されます。

   2.1.1.2 「TaqMan SNP Genotyping Assay」による NAFLD および NASH の遺伝子多型の検出は、ゲノムワイド解析で以前に同定された全ゲノムが NAFLD/NASH に関連付けられていることを示しています (エジプト人集団で検証予定)。 、COL13A1 rs1227756、NCAN rs2228603、LYPLAL1 rs12137855、GCKR rs780094、PPP1R3B rs4240624、PPAR rs1800234、MTTP rs1800591: すべての参加者から

   • Ｎａｎｏｄｒｏｐｐｅｒ ２０００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、米国のＱｉａｇｅｎによって供給されるＤＮＡ抽出キットを使用して、末梢血からＤＮＡを抽出する。
   • ＲｏｃｈｅリアルタイムＰＣＲシステム（ライトサイクラー４８０）とＴａｑＭａｎ対立遺伝子識別アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いてＳＮＰジェノタイピングを実施する。

   2.1.2 エピゲノム 血漿マイクロRNAの発現プロファイリング

   ・上位５つのｍｉＲＮＡの発現分析：水銀ＬＮＡ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたリアルタイムＰＣＲによって、すべての患者および対照において分析するために、上位５つの改変されたｍｉＲＮＡが選択される。 miRNA の Fold change は、2-ΔCt メソッドを使用して計算されます。

   2.1.3 グリコプロテオミクス: トランスフェリン、アポリポタンパク質 C III (apoC III)、ハプトグロビン、Mac2 結合タンパク質、IgG (Santa Cruz、USA) のグリコシル化パターンの同定。 T

   2.2 唾液サンプル: 2.2.1 唾液メタボロミクス 2.2.2 ガスクロマトグラフィー質量分析計 (GC-MS) を使用した代謝物の同定 分析: 同定された上位 5 つの微生物関連代謝物の濃度の評価サンプル) は、GC-MS 分析を使用して、すべての参加者のメタボロミクス バイオマーカーとして調査されます。

   2.2.3 いくつかの既知のメタゲノム機能の予測分析。 ラクトフェリン、リポ多糖類（LPS）、および免疫グロブリンA（IgA）の唾液濃度は、すべての参加者について決定されます。

3. 個別カウンセリングによる行動変容