Omics-pohjainen ennustaja NAFLD / potentiaalinen NASH

Kansallinen hoitoohjelma, jonka tarkoituksena oli tarjota parannus egyptiläisille HCV-tartunnan saaneille potilaille, oli kipinävalo kohti HCV-vapaata ja tervettä maksaa Egyptin väestön keskuudessa. Toinen nopeasti kehittyvä maksasairaus on kuitenkin ilmaantunut, ja kuolleisuus ja sairastuvuus ovat lisääntyneet, ja sen levinneisyys on arvioitu 25–35 %:ksi kaikkialla maailmassa. alkoholiton rasvamaksatauti (NAFLD). Korkein NAFLD-aste on Lähi-idästä (32 %). NAFLD:n esiintyvyys väestössä kasvaa iän myötä; 3 prosentista lapsilla, 5 prosentista teini-ikäisillä, 18 prosentilla 20–40-vuotiailla, 39 prosentilla 40–50-vuotiailla ja yli 40 prosenttiin yli 70-vuotiailla.

NAFLD on aineenvaihduntahäiriö, jonka kirjo etenee yksinkertaisesta steatoosista alkoholittomaan steatohepatiittiin (NASH) ja maksafibroosiin, mikä voi johtaa kirroosiin, hepatosellulaariseen karsinoomaan ja maksan vajaatoimintaan. Näin ollen NASH:ta pidetään vakavana NAFLD:n muotona. Kun otetaan huomioon yhteys NAFLD:n ja kasvavien maailmanlaajuisten liikalihavuuden, tyypin 2 diabeteksen, istuvien elämäntapojen, dyslipidemian ja epäterveellisten ruokailutottumusten välillä, NAFLD:n esiintyvyyden odotetaan kasvavan. Siksi NAFLD on merkittävä kliininen ja taloudellinen taakka maailman terveydenhuoltojärjestelmille.

Vaikka maksabiopsia on vertailustandardi NASH:iin liittyvän fibroosin arvioinnissa, invasiivisen toimenpiteen luontaiset rajoitukset ja toistuvan näytteenoton tarve ovat johtaneet useiden ei-invasiivisten testien (NIT) kehittämiseen vaihtoehtoina maksabiopsialle. . Nykyisiä NIT:itä käytettiin edenneen fibroosin diagnosoimiseen potilailla, joilla on NAFLD (5). Tällaisia ​​NIT:itä ovat enimmäkseen biologiset (seerumin biomarkkerialgoritmit) tai fyysiset (kudoksen jäykkyyden kuvantamisarviointi) arvioinnit. Tällä hetkellä saatavilla olevilla NIT:illä on kuitenkin useita rajoituksia, kuten vaihtelu, riittämätön tarkkuus ja virheen riskitekijät. Nykyisiä NIT:itä käytettiin paitsi kroonisen hepatiitti C:n merkittävän fibroosin diagnosoimiseen, myös edenneen fibroosin diagnosointiin potilailla, joilla oli NAFLD/NASH.

Huolimatta NAFLD:n suuresta esiintyvyydestä ja siitä, että sen varhaiset vaiheet ovat palautuvia ruokavalion ja elämäntapojen muutoksilla, NIT:n saatavuus on todennäköisesti rajoitettua, etenkin kalliimpien kuvantamispohjaisten testien osalta vähäresursseissa maissa. Veripohjaiset biomarkkerit ovat siksi houkuttelevia, mutta tähän mennessä saatavilla olevilla on vain kohtalainen diagnostinen tarkkuus. Lisäksi vain pieni osa NAFLD-tapauksista diagnosoidaan ja hoidetaan oikein, koska varhaisten vaiheiden havaitsemista estää ei-invasiivisten luotettavien ja validoitujen varhaisen diagnoosin menetelmien puute. Lisäksi NASH:n hallintaan on saatavilla vain vähän vaihtoehtoja, eikä NAFLD:lle ole olemassa FDA:n hyväksymiä hoitoja.

Tähän mennessä NAFLD:n patogeneesiä ei ole täysin selvitetty. NAFLD:n uskotaan osallistuvan monimutkaisiin vuorovaikutuksiin ruokavalion, geneettisen alttiuden ja suoliston mikrobiston välillä (6). Samaan aikaan suoliston mikrobiotan ja mikrobien metaboliittien rooli NAFLD:ssä on herättänyt enemmän huomiota. Suolen mikrobiota säätelee NAFLD:n kehittymistä ja etenemistä suoli-maksa-akselin perusteella. Tulevaisuudessa patogeenisiin reitteihin perustuvia kohdennettuja hoitostrategioita tarvitaan näin ollen tehokkaan hoidon kehittämiseksi NASH-potilaille.

Yleisesti ottaen tieteellisiä aloja, jotka liittyvät biologisten molekyylien mittaamiseen korkean suorituskyvyn tavalla, kutsutaan "omiikaksi". Vaikka meneillään oleva teknologinen kehitys omiikkateknologioissa, kuten genomiikassa, proteomiikassa ja metabolomiikassa, lupaa paljon hyödyllisten ei-invasiivisten biomarkkerien löytämiseksi ja NAFLD- ja NASH-diagnoosin, ennusteen ja lääkevasteen patofysiologisen ymmärtämisen lisäämiseksi. Suurin osa sovelsi yhtä omiikkatekniikkaa. Ihmisgenetiikan edistysaskeleet tarjoavat uusia mahdollisuuksia vastata NASH-hoitojen kiireelliseen tarpeeseen, mikä perustuu parempaan ymmärrykseen NASH:n kehittymisen geneettisten ja ympäristöriskitekijöiden välisestä vuorovaikutuksesta. MikroRNA:iden (miRNA:iden ilmoitettiin olevan läheistä sukua NAFLD:lle, koska ne kohdistuvat geeneihin, jotka osallistuvat lipidimetaboliaan ja tulehdusta edistäviin tekijöihin, jotka liittyvät NAFLD:n patogeneesiin. Lisäksi monet glykoproteiinit on yhdistetty maksasairauksien diagnosointiin, koska suurin osa seerumin glykoproteiineista syntetisoituu maksassa. Valitettavasti muutamat uraauurtavat tutkimukset ovat menestyksekkäästi soveltaneet multi-omiikkatekniikoita NAFLD/NASH:n tutkimiseen, joista yhtäkään ei tehty Egyptin väestön keskuudessa.

Tutkijat pyrkivät kehittämään multi-omics-yhdistelmän ennustavan biomarkkeripaneelin käytettäväksi egyptiläisenä pisteytysjärjestelmänä parantamaan NAFLD-diagnoosin ennustusvoimaa ja rajoittamaan sen etenemistä NASH:iin verrattuna perinteisiin markkereihin, jotka yleensä keskittyvät yhteen näkökohtaan. taudista. Tällaiset ennustavat biomarkkerit voivat myös hyödyttää NAFLD:n kliinistä hoitoa sen etenemisen rajoittamiseksi NASH:ksi.

Erityistavoitteet:

1. Tunnistaa dyslipidemiaa aiheuttavat funktionaaliset variantit ja sen aiheuttavat geenimutaatiot osallistujien osanäytteestä (30 potilasta) käyttämällä seuraavan sukupolven sekvensointia (NGS).
2. Merkittävimpien 10 geenin tunnistaminen ja tarkistaminen (aiemmin genominlaajuisissa analyyseissä todettu liittyvän NAFLD/NASH:iin) egyptiläisen väestön keskuudessa: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 KRSR545C, 29018rs , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 ja MTTP rs1800591 TaqMan SNP Genotyping Assaylla
3. Selvittää geneettisten variaatioiden mahdollista yhteyttä nykyisin käytettävään NAFLD:n hoitoon fibroosin kanssa ja ilman (esim. E-vitamiini, c-vitamiini, D-vitamiini; metformiini lapsille ja pioglitatsoni aikuisille…)
4. Tunnistaa plasman miRNA:iden ilmentymistaso (5 parasta plasman miRNA:n 168-paneeligeenistä) PCR-sarjan avulla tutkittujen ryhmien mukaan
5. Arvioida tällä hetkellä käytettyyn lääkkeeseen liittyvän muuttuneen miRNA:iden ilmentymisprofiilin potentiaalia NAFLD:n hoidossa ilman fibroosia tai sen kanssa.
6. Sekä N- että O-glykoproteiinien glykosylaatioprofiilin tunnistamiseksi osoitettiin olevan yhteys NAFLD/NASH:iin (transferriini, apolipoproteiini C III (apoC III), haptoglobiini, Mac2:ta sitova proteiini, IgG) -) egyptiläisillä potilailla, joilla oli NAFLD ilman tai ilman sitä. fibroosi
7. Arvioida tutkittujen glykoproteiinien glykosylaatiomallin välistä suhdetta vasteena tällä hetkellä käytettävälle lääkkeelle NAFLD:ssä FIBROOSIN kanssa JA ILMAN.
8. Tunnistaa egyptiläisistä populaatioista bakteeri-isolaatit, jotka liittyvät NAFLD-potilaisiin, joilla ei ole fibroosia ja joilla on fibroosi, sekä kontrollit (10:stä bakteeri-isolaatista) käyttämällä -Rapid RT-PCR -testiä 16S rRNA -geeniamplikonikirjaston valmistelua ja sekvensointia varten
9. Tunnistaa viisi suurinta syljestä havaittua mikrobiomiin liittyvää metaboliittia vertaamalla niiden pitoisuuksia NAFLD:lle ilman fibroosia ja sen kanssa sekä kontrollin avulla kaasukromatografia-massaspektrometri (GC-MS) -analyysillä
10. Arvioida joidenkin tunnettujen metagenomisten toimintojen yhteyttä käyttämällä Commercial ELISA -pakkauksia. (laktoferriinin, lipopolysakkaridin ja immunoglobuliini A:n syljen pitoisuudet NAFLD:n havaitsemiseksi ilman fibroosia ja sen kanssa.
11. Sen määrittämiseksi, voitaisiinko havaittujen syljen metaboliittien yhdistelmiä käyttää biomarkkerin allekirjoituksena NAFLD:n havaitsemiseen ilman fibroosia ja sen kanssa.
12. Tunnistaa epidemiologisen, ruokavalion ja elämäntavan vuorovaikutus ja vaikutus tutkittuihin multiomiikkabiomarkkereihin ja NAFLD:n kliiniseen esitykseen ilman fibroosia ja sen kanssa.

Tutkimusmenetelmät ja -välineet

Tämä tutkimus on poikkileikkaustutkimus, joka tehtiin 24 kuukauden työkaluilla:

1. Perustason arviointikysely:

   1.1 Sosiodemografisten ominaisuuksien arviointi, yksityiskohtainen historianotto ja muut tunnetut riskitekijät (suuhygienia…), perheen sukutaulun rakentaminen jopa kolmelle sukupolvelle geneettisten ja perhesyiden riskin diagnosoimiseksi NAFLD:lle ja NASH:lle 1.2 Ravitsemus- ja ruokavaliokäyttäytymisen arviointi antropometrisilla mittauksilla ruokavalion laatuindeksin arviointikyselyllä, juomien saanti

2. Tässä tutkimuksessa tutkitaan multi-omics-biomarkkereita veressä ja elossa. Lähestymistapa perustuu uusien molekyylipatogeneesien ja uusien geenien havaitsemiseen Egyptiin liittyvien biomarkkerien löytämiseksi tutkituista multiomiikkamarkkereista.

   2.1 Verinäytteet: Genomiikka

   2.1.1.1 Dyslipidemiaan osallistuvien geenien havaitseminen: Dyslipidemiasta vastuussa olevien funktionaalisten varianttien tunnistaminen käyttämällä dyslipidemian päägeenien seuraavan sukupolven sekvensointipaneeleja (NGS); (LDLR), (APOB), (PCSK9) ja (LDLRAP). Tämä tekniikka voi auttaa meitä tunnistamaan uusia dyslipidemiaan liittyviä muunnelmia ja ne, jotka liittyvät yleisesti Egyptin väestöön. Tätä sovelletaan 30 osallistujaan, joilla on vain diagnosoitu dyslipidemia.

   2.1.1.2 NAFLD:n ja NASH:n geenipolymorfismin havaitseminen "TaqMan SNP Genotyping Assaylla" koko genomille, joka on aiemmin tunnistettu genominlaajuisissa analyyseissä NAFLD/NASH-yhteyteen kytkettäväksi (varmistetaan egyptiläisväestöstä) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, PNPLA3 rs6006460,24 F6006460, , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 ja MTTP rs1800591: kaikilta osallistujilta

   • DNA uutetaan ääreisverestä käyttämällä Qiagenin, USA:n, toimittamaa DNA-uuttosarjaa käyttäen Nanodropper 2000:ta (ThermoScientific).
   • SNP-genotyypitys suoritetaan käyttämällä Rochen reaaliaikaista PCR-järjestelmää (light cycler 480) ja TaqMan-alleelin erottelumääritystä (Applied Biosystems, USA).

   2.1.2 Epi-genomiikka Plasman mikroRNA:iden ilmentymisen profilointi

   • Viiden suosituimman miRNA:n ilmentymisanalyysi: 5 parasta muuttunutta miRNA:ta valitaan analysoitaviksi kaikilta potilailta ja kontrolleilta reaaliaikaisella PCR:llä käyttäen elohopean LNA SYBR Green PCR -kittiä (Qiagen). MiRNA:n kertamuutos lasketaan 2-∆Ct-menetelmällä.

   2.1.3 Glykoproteomiikka: tunnistaa glykosylaatiokuvion transferriini, apolipoproteiini C III (apoC III), haptoglobiini, Mac2:ta sitova proteiini, IgG (Santa Cruz, USA). T

   2.2 Sylkinäytteet: 2.2.1 Sylkiaineenvaihdunta 2.2.2 Metaboliittien tunnistus kaasukromatografia-massaspektrometrillä (GC-MS) Analyysi: viiden suurimman tunnistetun mikrobiperäisen metaboliitin pitoisuuden arviointi (jota löytyy vähintään 85 %:sta näytteet) metabolomiikan biomarkkereina kaikkien osallistujien keskuudessa tutkitaan GC-MS-analyysin avulla.

   2.2.3 Joidenkin tunnettujen metagenomien toimintojen ennustava analyysi. Laktoferriinin, lipopolysakkaridin (LPS) ja immunoglobuliini A:n (IgA) syljen pitoisuudet määritetään kaikille osallistujille.

3. Käyttäytymisen muutos yksilöllisen neuvonnan avulla