Prediktory NAFLD/potenciální NASH založené na Omics

Národní léčebný program určený k vyléčení egyptských pacientů infikovaných HCV byl zábleskem pro zdravá játra bez HCV mezi egyptskou populací. Objevuje se však další rychle se vyvíjející onemocnění jater se zvýšením úmrtnosti i morbidity a odhadovanou prevalencí 25–35 % na celém světě; nealkoholické ztučnění jater (NAFLD). Nejvyšší míra NAFLD je hlášena ze Středního východu (32 %). Prevalence NAFLD v běžné populaci se zvyšuje s věkem; od 3 % u dětí, 5 % u dospívajících, 18 % mezi 20 a 40 lety, 39 % u osob ve věku 40 až 50 let a na více než 40 % u osob starších 70 let.

NAFLD je metabolická porucha, jejíž spektrum progreduje od prosté steatózy k nealkoholické steatohepatitidě (NASH) a fibróze jater, potenciálně vedoucí k cirhóze, hepatocelulárnímu karcinomu a selhání jater. V souladu s tím je NASH považována za těžkou formu NAFLD. Vzhledem k souvislosti mezi NAFLD a rostoucí globální epidemií obezity, diabetu 2. typu, sedavého životního stylu, dyslipidémie a nezdravých stravovacích návyků se očekává, že prevalence NAFLD poroste. Proto NAFLD představuje hlavní klinickou a ekonomickou zátěž pro světové zdravotnické systémy.

Ačkoli je jaterní biopsie referenčním standardem pro hodnocení fibrózy spojené s NASH, inherentní omezení invazivního postupu a potřeba opakovaného odběru vzorků vedly k vývoji několika neinvazivních testů (NIT) jako alternativy k jaterní biopsii. . Současné NIT byly použity pro diagnostiku pokročilé fibrózy u pacientů s NAFLD [5]. Takové NIT většinou zahrnují biologické (algoritmy sérových biomarkerů) nebo fyzikální (zobrazovací hodnocení tuhosti tkáně). V současnosti dostupné NIT však mají několik omezení, jako je variabilita, nedostatečná přesnost a rizikové faktory pro chyby. Současné NIT byly použity nejen k diagnostice významné fibrózy u chronické hepatitidy C, ale také k diagnostice pokročilé fibrózy u pacientů s NAFLD/NASH.

V zemích s nízkými zdroji, navzdory vysoké prevalenci NAFLD a skutečnosti, že její raná stadia jsou reverzibilní úpravou stravy a životního stylu, bude dostupnost NIT pravděpodobně omezená, zejména dražší testy založené na zobrazování. Biomarkery založené na krvi jsou proto atraktivní, ale ty, které jsou dosud k dispozici, mají pouze střední diagnostickou přesnost. Kromě toho je diagnostikována a správně léčena pouze menšina případů NAFLD, protože odhalení časných stadií brání nedostatek neinvazivních spolehlivých a ověřených metod časné diagnostiky. Kromě toho existuje několik dostupných možností pro léčbu NASH a žádné současné terapie NAFLD schválené FDA.

Dosud není patogeneze NAFLD zcela objasněna. Předpokládá se, že NAFLD se účastní komplexních interakcí mezi stravou, genetickou náchylností a střevní mikroflórou (6). Současně přitáhla větší pozornost role střevní mikroflóry a mikrobiálních metabolitů v NAFLD. Střevní mikrobiota reguluje vývoj a progresi NAFLD na základě osy střevo-játra. Budoucí cílené léčebné strategie založené na patogenních drahách jsou proto potřebné k vyvinutí účinné léčby pro pacienty s NASH.

Obecně řečeno, vědecké oblasti spojené s měřením biologických molekul vysoce výkonným způsobem se nazývají „omics“. I když pokračující technologický pokrok v omických technologiích, jako je genomika, proteomika a metabolomika, je velkým příslibem pro objev užitečných neinvazivních biomarkerů a zvýšené patofyziologické porozumění diagnóze NAFLD a NASH, prognóze a odpovědi na léky. Většina použila jednu omickou techniku. Pokroky v lidské genetice představují nové příležitosti k řešení naléhavé potřeby terapeutik NASH, založené na lepším pochopení interakce mezi genetickými a environmentálními rizikovými faktory pro rozvoj NASH. MikroRNA (uvádí se, že miRNA úzce souvisí s NAFLD cílením na geny zapojené do metabolismu lipidů a prozánětlivé faktory, které souvisejí s patogenezí NAFLD. Kromě toho bylo mnoho glykoproteinů spojeno s diagnózou jaterních poruch vzhledem k tomu, že většina sérových glykoproteinů je syntetizována v játrech. Bohužel několik průkopnických studií úspěšně použilo multi-omické technologie pro zkoumání NAFLD/NASH, z nichž žádná nebyla provedena mezi egyptskou populací.

Výzkumníci se zaměřili na vývoj multi-omického kompozitního prediktivního biomarkerového panelu, který by měl být použit jako egyptský skórovací systém pro zlepšení prediktivní schopnosti diagnózy NAFLD a omezení její progrese na NASH ve srovnání s tradičními markery, které se obvykle zaměřují na jeden aspekt. nemoci. Takové prediktivní biomarkery mohou být také přínosem pro klinickou léčbu NAFLD k omezení její progrese do NASH.

Konkrétní cíle:

1. Identifikovat funkční varianty způsobující dyslipidémii a mutace jejích kauzálních genů na dílčím vzorku účastníků (30 pacientů) pomocí sekvenování nové generace (NGS).
2. Identifikovat a ověřit nejvýznamnějších 10 genů (dříve identifikovaných jako asociované s NAFLD/NASH v celogenomových analýzách) v egyptské populaci: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 rs63212AN , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 a MTTP rs1800591 pomocí TaqMan SNP Genotyping Assay
3. Nastínit možnou souvislost genetických variací s aktuálně používanou léčbou NAFLD s fibrózou a bez ní (např. vitamín E, vitamín C, vitamín D; metformin pro děti a pioglitazon pro dospělé…)
4. Identifikovat úroveň exprese plazmatických miRNA (top 5 ze 168-panelových genů plazmatických miRNA) pomocí PCR pole podle studovaných skupin
5. Posoudit potenciál změněného profilu exprese miRNA spojeného s aktuálně používaným lékem pro léčbu NAFLD bez nebo s fibrózou.
6. Pro identifikaci glykosylačního profilu N- a O-glykoproteinů bylo prokázáno, že jsou spojeny s NAFLD/NASH (transferin, apolipoprotein C III (apoC III), haptoglobin, protein vázající Mac2, IgG) -) mezi egyptskými pacienty s NAFLD bez nebo s fibróza
7. Posoudit vztah mezi glykosylačním vzorcem studovaných glykoproteinů v reakci na aktuálně používaný lék pro NAFLD S A BEZ FIBRÓZY.
8. Identifikovat bakteriální izoláty mezi egyptskými populacemi, které jsou spojeny s pacienty s NAFLD bez a s fibrózou a kontrolami (z 10 bakteriálních izolátů) pomocí -Rapid RT-PCR testu pro přípravu a sekvenování amplikonové knihovny genu 16S rRNA
9. Identifikovat pět nejlepších metabolitů souvisejících s mikrobiomy detekovaných ve slinách porovnáním jejich koncentrací pro NAFLD bez a s fibrózou a kontrolou pomocí analýzy plynové chromatografie a hmotnostního spektrometru (GC-MS)
10. Posoudit asociaci některých známých metagenomických funkcí pomocí komerčních souprav ELISA. (koncentrace laktoferinu, lipopolysacharidu a imunoglobulinu A ve slinách pro detekci NAFLD bez a s fibrózou.
11. Stanovit, zda by kombinace detekovaných metabolitů ve slinách mohly být použity jako biomarkerový podpis pro detekci NAFLD bez a s fibrózou.
12. Identifikovat interakci a vliv epidemiologického, dietního a životního stylu na studované multiomické biomarkery a na klinický obraz NAFLD bez a s fibrózou.

Metodika a nástroje výzkumu

Tato studie je průřezovou průzkumnou studií prováděnou pomocí nástrojů po dobu 24 měsíců:

1. Základní hodnotící dotazník:

   1.1 Posouzení sociodemografických charakteristik, podrobné odebírání anamnézy a dalších známých rizikových faktorů (ústní hygiena….), konstrukce rodinného rodokmenu až do tří generací pro diagnostiku rizika genetických a rodinných příčin NAFLD a NASH 1.2 Nutriční a dietní hodnocení chování s antropometrickými měřeními pomocí dotazníku pro hodnocení indexu kvality stravy, příjem nápojů

2. V této studii budou zkoumány multi-omické biomarkery v krvi a naživu. Tento přístup je založen na detekci nových molekulárních patogenezí a nových genů pro objevování egyptských biomarkerů studovaných multi-omických markerů.

   2.1 Vzorky krve: Genomika

   2.1.1.1 Detekce genů podílejících se na dyslipidémii: Identifikace funkční varianty (variancí), která je zodpovědná za dyslipidémii, pomocí panelů sekvenování nové generace (NGS) hlavních genů dyslipidémie; (LDLR), (APOB), (PCSK9) a (LDLRAP). Tato technika nám může pomoci identifikovat nové varianty související s dyslipidémií a ty, které se běžně vztahují k egyptské populaci. Toto bude aplikováno na 30 účastníků, u kterých byla pouze diagnostikována dyslipidémie.

   2.1.1.2 Detekce genového polymorfismu pro NAFLD a NASH pomocí "TaqMan SNP Genotyping Assay" pro celý genom dříve identifikovaný v analýzách celého genomu, který má být spojen s NAFLD/NASH (bude ověřeno mezi egyptskou populací) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FD4450, FD45FT1 , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 a MTTP rs18005 od všech účastníků

   • DNA bude extrahována z periferní krve pomocí soupravy pro extrakci DNA dodané společností Qiagen, USA pomocí Nanodropper 2000 (ThermoScientific).
   • Genotypizace SNP bude provedena pomocí systému Roche real-time PCR (světelný cykler 480) s testem alelické diskriminace TaqMan (Applied Biosystems, USA).

   2.1.2 Epi-genomika Profilování exprese plazmatických mikroRNA

   • Analýza exprese 5 top miRNA: 5 top změněných miRNA bude vybráno k analýze u všech pacientů a kontrol pomocí PCR v reálném čase pomocí rtuťové LNA SYBR Green PCR kit (Qiagen). Záhybová změna miRNA bude vypočítána metodou 2-∆Ct.

   2.1.3 Glykoproteomika: identifikace glykosylačního vzorce transferin, apolipoprotein C III (apoC III), haptoglobin, protein vázající Mac2, IgG (Santa Cruz, USA). T

   2.2 Vzorky slin: 2.2.1 Metabolomika slin 2.2.2 Identifikace metabolitů pomocí analýzy plynové chromatografie a hmotnostního spektrometru (GC-MS): posouzení koncentrace pěti hlavních identifikovaných metabolitů souvisejících s mikroorganismy (které budou nalezeny alespoň v 85 % vzorky) jako metabolomické biomarkery mezi všemi účastníky budou zkoumány pomocí GC-MS analýzy.

   2.2.3 Prediktivní analýza některých známých metagenomických funkcí. Všem účastníkům budou stanoveny koncentrace laktoferinu, lipopolysacharidu (LPS) a imunoglobulinu A (IgA) ve slinách.

3. Modifikace chování prostřednictvím individuálního poradenství