Omics-baserade prediktorer för NAFLD/potentiell NASH

Det nationella behandlingsprogrammet som var avsett att ge ett botemedel för egyptiska HCV-infekterade patienter var det gnistrande ljuset mot en HCV-fri och frisk lever bland den egyptiska befolkningen. En annan snabbt utvecklande leversjukdom har dock dykt upp med en ökning av både mortalitet och sjuklighet, och en uppskattad prevalens på 25-35 % över hela världen; icke-alkoholisk fettleversjukdom (NAFLD). Den högsta andelen NAFLD rapporteras från Mellanöstern (32%). Prevalensen av NAFLD i den allmänna befolkningen ökar med åldern; från 3 % hos barn, 5 % hos tonåringar, 18 % mellan 20 och 40 år, 39 % hos dem i åldrarna 40 till 50 år och till över 40 % hos de äldre än 70 år.

NAFLD är en metabolisk störning, vars spektrum går från enkel steatos till icke-alkoholisk steatohepatit (NASH) och leverfibros, vilket potentiellt leder till cirros, hepatocellulärt karcinom och leversvikt. Följaktligen anses NASH vara en allvarlig form av NAFLD. Med tanke på sambandet mellan NAFLD och de växande globala epidemierna av fetma, typ 2-diabetes, stillasittande livsstilar, dyslipidemi och ohälsosamma kostmönster, förväntas prevalensen av NAFLD att öka. Därför är NAFLD en stor klinisk och ekonomisk börda för världens sjukvårdssystem.

Även om leverbiopsi är referensstandarden för bedömning av fibros associerad med NASH, har de inneboende begränsningarna av en invasiv procedur, och behovet av upprepad provtagning, lett till utvecklingen av flera icke-invasiva tester (NIT) som alternativ till leverbiopsier . De nuvarande NIT:erna användes för diagnos av avancerad fibros hos patienter med NAFLD (5), Sådana NITs inkluderar mestadels biologiska (serumbiomarköralgoritmer) eller fysiska (avbildningsbedömning av vävnadsstyvhet) bedömningar. Men för närvarande tillgängliga NIT har flera begränsningar, såsom variabilitet, otillräcklig noggrannhet och riskfaktorer för fel. De nuvarande NIT:erna användes inte bara för att diagnostisera signifikant fibros vid kronisk hepatit C utan också för att diagnostisera avancerad fibros hos patienter med NAFLD/NASH.

I länder med låga resurser, trots den höga prevalensen av NAFLD och att dess tidiga stadier är reversibla med kost- och livsstilsförändringar, är tillgängligheten av NIT sannolikt begränsad, särskilt de dyrare avbildningsbaserade testerna. Blodbaserade biomarkörer är därför attraktiva, men de som finns tillgängliga hittills har endast måttlig diagnostisk noggrannhet. Vidare är endast en minoritet av NAFLD-fallen diagnostiserade och korrekt behandlade, eftersom upptäckt av tidiga stadier hindras av brist på icke-invasiva tillförlitliga och validerade metoder för tidig diagnos. Dessutom finns det få alternativ tillgängliga för hantering av NASH och inga aktuella FDA-godkända behandlingar för NAFLD.

Hittills är patogenesen av NAFLD inte helt klarlagd. NAFLD tros vara involverad i komplexa interaktioner mellan kost, genetisk känslighet och tarmmikrobiota (6). Samtidigt har rollen som tarmmikrobiota och mikrobiella metaboliter i NAFLD väckt mer uppmärksamhet. Tarmmikrobiota reglerar utvecklingen och progressionen av NAFLD på basis av tarm-leveraxeln. Framtida riktade behandlingsstrategier baserade på de patogena vägarna behövs därför för att utveckla en effektiv behandling för patienter med NASH.

I stort sett kallas de vetenskapliga områden som är förknippade med att mäta de biologiska molekylerna på ett sätt med hög genomströmning "omics". Även om pågående tekniska framsteg inom omics-teknologier som genomik, proteomik och metabolomik har stora löften för upptäckten av användbara icke-invasiva biomarkörer och ökad patofysiologisk förståelse av NAFLD- och NASH-diagnos, prognos och läkemedelssvar. Majoriteten tillämpade en omics-teknik. Framsteg inom mänsklig genetik ger nya möjligheter att ta itu med det akuta behovet av NASH-terapi, baserat på en förbättrad förståelse för samspelet mellan de genetiska och miljömässiga riskfaktorerna för utvecklingen av NASH. MikroRNA (miRNA rapporterades vara nära besläktade med NAFLD genom att rikta in sig på gener involverade i lipidmetabolism och pro-inflammatoriska faktorer som är relaterade till patogenesen av NAFLD. Dessutom har många glykoproteiner kopplats till diagnosen av leversjukdomar med tanke på att majoriteten av serumglykoproteinerna syntetiseras i levern. Tyvärr har några banbrytande studier framgångsrikt tillämpat multi-omics-teknologier för att undersöka NAFLD/NASH, varav ingen gjordes bland den egyptiska befolkningen.

Utredarna syftade till att utveckla en multiomics sammansatt prediktiv biomarkörpanel för att användas som ett egyptiskt poängsystem för att förbättra prediktiva kraften hos diagnosen NAFLD och begränsa dess progression till NASH, jämfört med de traditionella markörerna som vanligtvis fokuserar på en enskild aspekt av sjukdomen. Sådana prediktiva biomarkörer kan också gynna den kliniska hanteringen av NAFLD för att begränsa dess progression till NASH.

Specifika mål:

1. För att identifiera de funktionella varianterna som orsakar dyslipidemi och dess orsakande gener mutation på ett delprov av deltagare (30 patienter) med hjälp av nästa generations sekvensering (NGS).
2. To identify and verify the most significant 10 genes (previously identified to be associated with NAFLD/NASH in genome-wide analyses) among the Egyptian population: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094 , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 och MTTP rs1800591 med TaqMan SNP Genotyping Assay
3. Att beskriva det möjliga sambandet av genetiska variationer med den för närvarande använda behandlingen för NAFLD med och utan fibros (t.ex. vitamin E, vitamin c, vitamin D; metformin för barn och pioglitazon för vuxna ...)
4. För att identifiera uttrycksnivån för plasma miRNA (de 5 översta av 168-panelgener av plasma miRNA) genom PCR-array enligt de studerade grupperna
5. För att bedöma potentialen för förändrad miRNAs uttrycksprofil associerad med för närvarande använda läkemedel för behandling av NAFLD utan eller med fibros.
6. För att identifiera glykosyleringsprofilen för både N- och O-glykoproteiner visade sig vara kopplad till NAFLD/NASH (transferrin, apolipoprotein C III (apoC III), haptoglobin, Mac2-bindande protein, IgG) -) bland egyptiska patienter med NAFLD utan eller med fibros
7. Att bedöma sambandet mellan glykosyleringsmönstret för de studerade glykoproteinerna som svar på för närvarande använda läkemedel för NAFLD MED OCH UTAN FIBROS-behandling.
8. Att identifiera de bakteriella isolaten bland de egyptiska populationerna som är kopplade till NAFLD-patienter utan och med fibros och kontroller (av 10 bakterieisolat) med hjälp av -Rapid RT-PCR-test för 16S rRNA-gen amplikonbibliotek förberedelse och sekvensering
9. Att identifiera de fem främsta salivdetekterade mikrobiomrelaterade metaboliterna genom att jämföra deras koncentrationer för NAFLD utan och med fibros och kontroll med hjälp av gaskromatografi-masspektrometer (GC-MS) analys
10. För att bedöma associeringen av några kända meta-genomiska funktioner med hjälp av kommersiella ELISA-kit. (salivkoncentrationer av laktoferrin, lipopolysackarid och immunglobulin A för att detektera NAFLD utan och med fibros.
11. För att avgöra om kombinationer av de detekterade salivmetaboliterna kan användas som en biomarkörsignatur för att detektera NAFLD utan och med fibros.
12. Att identifiera interaktionen och påverkan av den epidemiologiska, dietära livsstilen på de studerade multi-omics biomarkörerna och på den kliniska presentationen av NAFLD utan och med fibros.

Forskningsmetodik och verktyg

Denna studie är en tvärsnittsutredande studie utförd med 24 månaders verktyg:

1. Baseline Assessment Questionnaire:

   1.1 Bedömning av sociodemografiska egenskaper, detaljerad anamnestagning och andra kända riskfaktorer (munhygien...), familjestamtavla upp till tre generationer för att diagnostisera risken för genetiska och familjära orsaker för NAFLD och NASH 1.2 Nutritions- och dietbeteendebedömning med antropometriska mätningar med hjälp av Diet Quality index assessment questionnaire, dryckesintag

2. Multi-omics biomarkörer i blod och levande kommer att undersökas i denna studie. Tillvägagångssättet är baserat på att detektera nya molekylära patogeneser och nya gener för att upptäcka egyptiska relaterade biomarkörer för de studerade multiomics-markörerna.

   2.1 Blodprover: Genomik

   2.1.1.1 Detektion av gener involverade i dyslipidemi: Identifiering av funktionella variant(er) som är ansvarig för dyslipidemi med hjälp av nästa generations sekvenseringspaneler (NGS) av dyslipidemi huvudgener; (LDLR), (APOB), (PCSK9) och (LDLRAP). Denna teknik kan hjälpa oss att identifiera nya dyslipidemi-relaterade varianter och de som vanligtvis är relaterade till den egyptiska befolkningen. Detta kommer att tillämpas på 30 deltagare som endast diagnostiserats med dyslipidemi.

   2.1.1.2 Detektering av genpolymorfism för NAFLD och NASH med "TaqMan SNP Genotyping Assay" för hela genomet som tidigare identifierats i genomomfattande analyser för att kopplas till NAFLD/NASH (som ska verifieras bland den egyptiska befolkningen) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006450, FNPLA3 rs600645rs , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 och 81MT05rs från alla deltagare

   • DNA kommer att extraheras från det perifera blodet med hjälp av ett DNA-extraktionskit från Qiagen, USA med hjälp av Nanodropper 2000 (ThermoScientific).
   • SNP-genotypning kommer att utföras med hjälp av Roches realtids-PCR-system (ljuscykler 480) med TaqMan-allelisk diskrimineringsanalys (Applied Biosystems, USA).

   2.1.2 Epi-genomics Expressionsprofilering av plasmamikroRNA

   • Expressionsanalys av topp 5 miRNA: De 5 översta ändrade miRNA:erna kommer att väljas ut för att analyseras i alla patienter och kontroller med realtids-PCR med kvicksilver LNA SYBR Green PCR-kit (Qiagen). Vikförändring av miRNA kommer att beräknas med 2-∆Ct-metoden.

   2.1.3 Glykoproteomik: identifiering av glykosyleringsmönstret transferrin, apolipoprotein C III (apoC III), haptoglobin, Mac2-bindande protein, IgG (Santa Cruz, USA). T

   2.2 Salivprover: 2.2.1 Salivmetabolomik 2.2.2 Identifiering av metaboliter med hjälp av gaskromatografi-masspektrometer (GC-MS) Analys: bedömning av koncentrationen av de fem främsta identifierade mikrobiellt relaterade metaboliterna (som kommer att finnas i minst 85 % av prover) som metabolomiska biomarkörer bland alla deltagare kommer att undersökas med GC-MS-analys.

   2.2.3 Prediktiv analys av några kända meta-genomiska funktioner. Salivkoncentrationerna av laktoferrin, lipopolysackarid (LPS) och immunglobulin A (IgA) kommer att bestämmas för alla deltagare.

3. Beteendeförändring genom individuell rådgivning