Omics-baserte prediktorer for NAFLD / potensiell NASH

Det nasjonale behandlingsprogrammet ment å gi en kur for egyptiske HCV-infiserte pasienter var det gnistrende lyset mot en HCV-fri og sunn lever blant den egyptiske befolkningen. Imidlertid har en annen raskt utviklende leversykdom dukket opp med en økning i både dødelighet og sykelighet, og en estimert prevalens på 25-35 % over hele kloden; ikke-alkoholisk fettleversykdom (NAFLD). Den høyeste frekvensen av NAFLD er rapportert fra Midtøsten (32%). Prevalensen av NAFLD i den generelle befolkningen øker med alderen; fra 3 % hos barn, 5 % hos tenåringer, 18 % mellom 20 og 40 år, 39 % hos de i alderen 40 til 50 år, og til over 40 % hos de eldre enn 70 år.

NAFLD er en metabolsk lidelse, hvis spektrum utvikler seg fra enkel steatose til ikke-alkoholisk steatohepatitt (NASH) og leverfibrose, som potensielt kan føre til skrumplever, hepatocellulært karsinom og leversvikt. Følgelig regnes NASH som en alvorlig form for NAFLD. Gitt sammenhengen mellom NAFLD og de økende globale epidemiene av fedme, type 2 diabetes, stillesittende livsstil, dyslipidemi og usunne kostholdsmønstre, forventes prevalensen av NAFLD å øke. Derfor er NAFLD en stor klinisk og økonomisk belastning for verdens helsevesen.

Selv om leverbiopsi er referansestandarden for vurdering av fibrose assosiert med NASH, har de iboende begrensningene ved en invasiv prosedyre, og behovet for gjentatt prøvetaking, ført til utviklingen av flere ikke-invasive tester (NIT) som alternativer til leverbiopsi. . De nåværende NIT-ene ble brukt for diagnostisering av avansert fibrose hos pasienter med NAFLD (5), Slike NIT-er inkluderer for det meste biologiske (serumbiomarkøralgoritmer) eller fysiske (bildevurdering av vevsstivhet) vurderinger. Imidlertid har tilgjengelige NIT-er flere begrensninger, som variabilitet, utilstrekkelig nøyaktighet og risikofaktorer for feil. De nåværende NIT-ene ble ikke bare brukt til å diagnostisere signifikant fibrose ved kronisk hepatitt C, men også diagnosen avansert fibrose hos pasienter med NAFLD/NASH.

I land med lav ressurser, til tross for den høye utbredelsen av NAFLD og at dens tidlige stadier er reversible med kostholds- og livsstilsendringer, er tilgjengeligheten av NIT sannsynligvis begrenset, spesielt de dyrere bildebaserte testene. Blodbaserte biomarkører er derfor attraktive, men de som er tilgjengelige til dags dato har bare moderat diagnostisk nøyaktighet. Videre er bare et mindretall av NAFLD-tilfeller diagnostisert og korrekt behandlet, da det å oppdage tidlige stadier hindres av mangel på ikke-invasive pålitelige og validerte metoder for tidlig diagnose. I tillegg er det få alternativer tilgjengelig for behandling av NASH og ingen nåværende FDA-godkjente terapier for NAFLD.

Til dags dato er patogenesen til NAFLD ikke fullstendig avklart. NAFLD antas å være involvert i komplekse interaksjoner mellom kosthold, genetisk følsomhet og tarmmikrobiota (6). Samtidig har rollen til tarmmikrobiota og mikrobielle metabolitter i NAFLD tiltrukket seg mer oppmerksomhet. Tarmmikrobiota regulerer utviklingen og progresjonen av NAFLD på grunnlag av tarm-lever-aksen. Fremtidige målrettede behandlingsstrategier basert på de patogene veiene er derfor nødvendig for å utvikle en effektiv behandling for pasienter med NASH.

Stort sett kalles de vitenskapelige feltene som er knyttet til å måle de biologiske molekylene på en high-throughput måte "omics". Selv om pågående teknologiske fremskritt innen omics-teknologier som genomikk, proteomikk og metabolomikk har store løfter for oppdagelsen av nyttige ikke-invasive biomarkører og økt patofysiologisk forståelse av NAFLD- og NASH-diagnose, prognose og medikamentrespons. Flertallet brukte én omics-teknikk. Fremskritt innen menneskelig genetikk gir nye muligheter for å møte det presserende behovet for NASH-terapi, basert på en forbedret forståelse av samspillet mellom genetiske og miljømessige risikofaktorer for utvikling av NASH. MikroRNA (miRNA ble rapportert å være nært relatert til NAFLD ved å målrette mot gener involvert i lipidmetabolisme og pro-inflammatoriske faktorer som er relatert til patogenesen til NAFLD. I tillegg har mange glykoproteiner blitt knyttet til diagnosen leversykdommer gitt at flertallet av serumglykoproteiner syntetiseres i leveren. Dessverre har noen få banebrytende studier vellykket brukt multi-omics-teknologier for å undersøke NAFLD/NASH, hvorav ingen ble gjort blant den egyptiske befolkningen.

Etterforskerne hadde som mål å utvikle et multi-omics sammensatt prediktivt biomarkørpanel som skal brukes som et egyptisk skåringssystem for å forbedre prediksjonskraften til diagnosen NAFLD og begrense progresjonen til NASH, sammenlignet med de tradisjonelle markørene som vanligvis fokuserer på et enkelt aspekt av sykdommen. Slike prediktive biomarkører kan også være til nytte for den kliniske behandlingen av NAFLD for å begrense progresjonen til NASH.

Spesifikke mål:

1. For å identifisere de funksjonelle variantene som forårsaker dyslipidemi og dens forårsakende genmutasjon på en delprøve av deltakere (30 pasienter) ved bruk av neste generasjons sekvensering (NGS).
2. For å identifisere og verifisere de mest betydningsfulle 10 genene (tidligere identifisert for å være assosiert med NAFLD/NASH i genomomfattende analyser) blant den egyptiske befolkningen: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 76KRs 812A1 72KRs, 812A1 751 701 701 700 312A1 701 700 25 25 312 2NC 5, 701 701 75 312 rs, 701 700 25 15 20 7 7 2 3 1 2 7 2 7 3 1 7 2 7 3 1 2 7 7 2 5 , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 og MTTP rs1800591 ved bruk av TaqMan SNP Genotyping Assay
3. Å skissere den mulige assosiasjonen av genetiske variasjoner med den for tiden brukte behandlingen for NAFLD med og uten fibrose (f.eks. vitamin E, vitamin c, vitamin D; metformin for barn og pioglitazon for voksne ...)
4. For å identifisere ekspresjonsnivået til plasma-miRNA-er (de 5 beste av 168-panelgenene til plasma-miRNA-er) ved PCR-array i henhold til de studerte gruppene
5. For å vurdere potensialet til endret miRNAs ekspresjonsprofil assosiert med for tiden brukt medikament for behandling av NAFLD uten eller med fibrose.
6. For å identifisere glykosyleringsprofilen til både N- og O-glykoproteiner viste det seg å være knyttet til NAFLD/NASH (transferrin, apolipoprotein C III (apoC III), haptoglobin, Mac2-bindende protein, IgG) -) blant egyptiske pasienter med NAFLD uten eller med fibrose
7. For å vurdere forholdet mellom glykosyleringsmønsteret til de studerte glykoproteinene som respons på for tiden brukt medikament for NAFLD MED OG UTEN FIBROSES-behandling.
8. For å identifisere bakterieisolatene blant de egyptiske populasjonene som er knyttet til NAFLD-pasienter uten og med fibrose og kontroller (av 10 bakterieisolater) ved å bruke -Rapid RT-PCR-test for 16S rRNA-gen amplikonbibliotek forberedelse og sekvensering
9. For å identifisere de fem beste spyttdetekterte mikrobiom-relaterte metabolittene ved å sammenligne deres konsentrasjoner for NAFLD uten og med fibrose og kontroll ved hjelp av gasskromatografi-massespektrometer (GC-MS) analyse
10. For å vurdere assosiasjonen til noen kjente meta-genomiske funksjoner ved bruk av kommersielle ELISA-sett. (spyttkonsentrasjoner av laktoferrin, lipopolysakkarid og immunglobulin A for påvisning av NAFLD uten og med fibrose.
11. For å bestemme om kombinasjoner av de påviste spyttmetabolittene kan brukes som en biomarkørsignatur for å påvise NAFLD uten og med fibrose.
12. Å identifisere interaksjonen og påvirkningen av den epidemiologiske, kostholdsmessige livsstilen på de studerte multi-omics biomarkørene og på den kliniske presentasjonen av NAFLD uten og med fibrose.

Forskningsmetodikk og verktøy

Denne studien er en tverrsnittsutforskende studie utført med 24 måneders verktøy:

1. Baseline Assessment Spørreskjema:

   1.1 Vurdering av sosiodemografiske kjennetegn, detaljert historieopptak og andre kjente risikofaktorer (munnhygiene...), familie stamtavlekonstruksjon opp til tre generasjoner for å diagnostisere risikoen for genetiske og familiære årsaker for NAFLD og NASH 1.2 Ernæringsmessig og kostholdsmessig atferdsvurdering med antropometriske målinger ved bruk av Diet Quality Index vurdering spørreskjema, drikkeinntak

2. Multi-omics biomarkører i blod og levende vil bli undersøkt i denne studien. Tilnærmingen er basert på å oppdage nye molekylære patogeneser og nye gener for å oppdage egyptisk-relaterte biomarkører av de studerte multi-omics-markørene.

   2.1 Blodprøver: Genomikk

   2.1.1.1 Påvisning av gener involvert i dyslipidemi: Identifikasjon av funksjonelle variant(er) som er ansvarlig for dyslipidemi ved bruk av neste generasjons sekvenseringspanel (NGS) av hovedgener for dyslipidemi; (LDLR), (APOB), (PCSK9) og (LDLRAP). Denne teknikken kan hjelpe oss med å identifisere nye dyslipidemi-relaterte varianter og de som vanligvis er relatert til den egyptiske befolkningen. Dette vil bli brukt på 30 deltakere kun diagnostisert med dyslipidemi.

   2.1.1.2 Påvisning av genpolymorfisme for NAFLD og NASH ved "TaqMan SNP Genotyping Assay" for hele genomet som tidligere er identifisert i genomomfattende analyser for å bli koblet til NAFLD/NASH (som skal verifiseres blant den egyptiske befolkningen) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006445rs, FNPLA3 rs600645rs , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 og 81MT05rs

   • DNA vil bli ekstrahert fra det perifere blodet ved hjelp av et DNA-ekstraksjonssett levert av Qiagen, USA ved bruk av Nanodropper 2000 (ThermoScientific).
   • SNP Genotyping vil bli utført ved hjelp av Roche sanntids PCR-system (light cycler 480) med TaqMan alleldiskrimineringsanalyse (Applied Biosystems, USA).

   2.1.2 Epi-genomics Ekspresjonsprofilering av plasma mikroRNA

   • Ekspresjonsanalyse av topp 5 miRNA: De 5 mest endrede miRNAene vil bli valgt ut for å bli analysert i alle pasienter og kontroller ved sanntids PCR ved bruk av kvikksølv LNA SYBR Green PCR kit (Qiagen). Foldendring av miRNA vil bli beregnet ved hjelp av 2-∆Ct-metoden.

   2.1.3 Glykoproteomikk: identifisere glykosyleringsmønsteret transferrin, apolipoprotein C III (apoC III), haptoglobin, Mac2-bindende protein, IgG (Santa Cruz, USA). T

   2.2 Spyttprøver: 2.2.1 Spyttmetabolomikk 2.2.2 Metabolitteridentifikasjon ved bruk av gasskromatografi-massespektrometer (GC-MS) Analyse: vurdere konsentrasjonen av de fem beste identifiserte mikrobielle-relaterte metabolittene (som vil finnes i minst 85 % av prøver) som metabolomiske biomarkører blant alle deltakerne vil bli undersøkt ved hjelp av GC-MS-analyse.

   2.2.3 Prediktiv analyse av noen kjente meta-genomiske funksjoner. Spyttkonsentrasjonene av laktoferrin, lipopolysakkarid (LPS) og immunglobulin A (IgA) vil bli bestemt for alle deltakere.

3. Atferdsendring gjennom individuell rådgivning