Predyktory NAFLD/Potencjalnego NASH oparte na omice

Narodowy program leczenia mający na celu wyleczenie egipskich pacjentów zakażonych HCV był iskierką w kierunku wolnej od HCV i zdrowej wątroby wśród egipskiej populacji. Jednak pojawia się inna szybko rozwijająca się choroba wątroby, która wiąże się ze wzrostem zarówno śmiertelności, jak i zachorowalności, a szacowana częstość występowania na całym świecie wynosi 25-35%. niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD). Najwyższy wskaźnik NAFLD odnotowano na Bliskim Wschodzie (32%). Częstość występowania NAFLD w populacji ogólnej wzrasta wraz z wiekiem; od 3% u dzieci, 5% u nastolatków, 18% w wieku od 20 do 40 lat, 39% u osób w wieku od 40 do 50 lat i do ponad 40% u osób w wieku powyżej 70 lat.

NAFLD jest zaburzeniem metabolicznym, którego spektrum rozwija się od prostego stłuszczenia do niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH) i zwłóknienia wątroby, potencjalnie prowadzącego do marskości, raka wątrobowokomórkowego i niewydolności wątroby. W związku z tym NASH jest uważany za ciężką postać NAFLD. Biorąc pod uwagę związek między NAFLD a rosnącą globalną epidemią otyłości, cukrzycy typu 2, siedzącego trybu życia, dyslipidemii i niezdrowych wzorców żywieniowych, oczekuje się, że częstość występowania NAFLD będzie rosła. Dlatego NAFLD jest głównym klinicznym i ekonomicznym obciążeniem światowych systemów opieki zdrowotnej.

Chociaż biopsja wątroby jest standardem referencyjnym do oceny zwłóknienia związanego z NASH, nieodłączne ograniczenia procedury inwazyjnej i potrzeba ponownego pobierania próbek doprowadziły do ​​opracowania kilku testów nieinwazyjnych (NIT) jako alternatywy dla biopsji wątroby . Obecne NIT były stosowane w diagnostyce zaawansowanego włóknienia u pacjentów z NAFLD (5). Takie NIT obejmują głównie oceny biologiczne (algorytmy biomarkerów surowicy) lub fizyczne (obrazowa ocena sztywności tkanek). Jednak obecnie dostępne NIT mają kilka ograniczeń, takich jak zmienność, niewystarczająca dokładność i czynniki ryzyka błędu. Obecne NIT były stosowane nie tylko do diagnozowania znacznego zwłóknienia w przewlekłym wirusowym zapaleniu wątroby typu C, ale także do diagnozy zaawansowanego zwłóknienia u pacjentów z NAFLD/NASH.

W krajach o niskich zasobach, pomimo dużej częstości występowania NAFLD i tego, że jej wczesne stadia są odwracalne dzięki modyfikacjom diety i stylu życia, dostępność NIT będzie prawdopodobnie ograniczona, zwłaszcza w przypadku droższych badań obrazowych. Biomarkery krwi są zatem atrakcyjne, ale te dostępne do tej pory mają jedynie umiarkowaną dokładność diagnostyczną. Co więcej, tylko niewielka część przypadków NAFLD jest diagnozowana i prawidłowo leczona, ponieważ wykrycie wczesnych stadiów jest utrudnione przez brak nieinwazyjnych, rzetelnych i zwalidowanych metod wczesnego diagnozowania. Ponadto dostępnych jest niewiele opcji zarządzania NASH i nie ma obecnie zatwierdzonych przez FDA terapii NAFLD.

Do chwili obecnej patogeneza NAFLD nie jest w pełni wyjaśniona. Uważa się, że NAFLD bierze udział w złożonych interakcjach między dietą, podatnością genetyczną i mikroflorą jelitową (6). Jednocześnie coraz więcej uwagi poświęca się roli mikroflory jelitowej i metabolitów drobnoustrojów w NAFLD. Mikrobiota jelitowa reguluje rozwój i progresję NAFLD na podstawie osi jelitowo-wątrobowej. W związku z tym potrzebne są przyszłe ukierunkowane strategie leczenia oparte na szlakach patogennych, aby opracować skuteczne leczenie pacjentów z NASH.

Ogólnie rzecz biorąc, dziedziny nauki związane z pomiarami molekuł biologicznych w sposób wysokowydajny nazywane są „omiki”. Chociaż postęp technologiczny w technologiach omicznych, takich jak genomika, proteomika i metabolomika, jest bardzo obiecujący w zakresie odkrycia użytecznych nieinwazyjnych biomarkerów i lepszego zrozumienia patofizjologicznego diagnozy NAFLD i NASH, prognozy i odpowiedzi na leki. Większość stosowała jedną technikę omiczną. Postępy w genetyce człowieka stwarzają nowe możliwości zaspokojenia pilnej potrzeby terapii NASH, w oparciu o lepsze zrozumienie interakcji między genetycznymi i środowiskowymi czynnikami ryzyka rozwoju NASH. Doniesiono, że mikroRNA (miRNA są blisko spokrewnione z NAFLD poprzez celowanie w geny zaangażowane w metabolizm lipidów i czynniki prozapalne, które są związane z patogenezą NAFLD. Ponadto wiele glikoprotein powiązano z diagnozą zaburzeń wątroby, ponieważ większość glikoprotein w surowicy jest syntetyzowana w wątrobie. Niestety, w kilku pionierskich badaniach z powodzeniem zastosowano technologie multiomiczne do badania NAFLD/NASH, z których żadne nie zostało przeprowadzone w populacji egipskiej.

Badacze dążyli do opracowania wieloomicznego złożonego predykcyjnego panelu biomarkerów do wykorzystania jako egipski system punktacji w celu poprawy mocy predykcyjnej diagnozy NAFLD i ograniczenia jej progresji do NASH, w porównaniu z tradycyjnymi markerami, które zwykle koncentrują się na jednym aspekcie choroby. Takie prognostyczne biomarkery mogą również przynieść korzyści w leczeniu klinicznym NAFLD w celu ograniczenia jej progresji do NASH.

Konkretne cele:

1. Aby zidentyfikować warianty funkcjonalne powodujące dyslipidemię i mutacje genów sprawczych na podgrupie uczestników (30 pacjentów) przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji (NGS).
2. Aby zidentyfikować i zweryfikować 10 najważniejszych genów (wcześniej zidentyfikowanych jako związane z NAFLD/NASH w analizach całego genomu) wśród populacji egipskiej: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 i MTTP rs1800591 przy użyciu testu genotypowania TaqMan SNP
3. Przedstawienie możliwego związku zmienności genetycznej z obecnie stosowanym leczeniem NAFLD ze zwłóknieniem i bez (np. witamina E, witamina C, witamina D; metformina dla dzieci i pioglitazon dla dorosłych…)
4. Identyfikacja poziomu ekspresji miRNA osocza (5 najlepszych ze 168-panelowych genów miRNA osocza) za pomocą macierzy PCR zgodnie z badanymi grupami
5. Ocena potencjału zmienionego profilu ekspresji miRNA związanego z obecnie stosowanym lekiem w leczeniu NAFLD bez lub ze zwłóknieniem.
6. Aby zidentyfikować profil glikozylacji zarówno N-, jak i O-glikoprotein, które okazały się być powiązane z NAFLD/NASH (transferyna, apolipoproteina C III (apoC III), haptoglobina, białko wiążące Mac2, IgG) -) wśród egipskich pacjentów z NAFLD bez lub z zwłóknienie
7. Ocena zależności między wzorcem glikozylacji badanych glikoprotein w odpowiedzi na aktualnie stosowany lek w leczeniu NAFLD Z WŁÓKNIENIEM I BEZ WŁÓKNIENIA.
8. Identyfikacja izolatów bakteryjnych wśród populacji egipskich, które są powiązane z pacjentami z NAFLD bez i ze zwłóknieniem oraz kontrolami (spośród 10 izolatów bakteryjnych) za pomocą testu -Rapid RT-PCR do przygotowania i sekwencjonowania biblioteki amplikonu genu 16S rRNA
9. Aby zidentyfikować pięć najczęściej wykrywanych metabolitów związanych z mikrobiomem w ślinie, porównując ich stężenia dla NAFLD bez zwłóknienia i ze zwłóknieniem oraz kontroli za pomocą analizy metodą chromatografii gazowej ze spektrometrem masowym (GC-MS)
10. Aby ocenić powiązanie niektórych znanych funkcji metagenomicznych przy użyciu komercyjnych zestawów ELISA. (stężenia laktoferyny, lipopolisacharydu i immunoglobuliny A w ślinie do wykrywania NAFLD bez i ze zwłóknieniem.
11. Aby ustalić, czy kombinacje wykrytych metabolitów śliny można wykorzystać jako sygnaturę biomarkera do wykrywania NAFLD bez zwłóknienia i ze zwłóknieniem.
12. Identyfikacja interakcji i wpływu epidemiologicznego, dietetycznego stylu życia na badane biomarkery multiomiczne oraz na obraz kliniczny NAFLD bez włóknienia iz włóknieniem.

Metodologia i narzędzia badawcze

Niniejsze badanie jest przekrojowym badaniem eksploracyjnym przeprowadzonym w ramach 24-miesięcznych narzędzi:

1. Kwestionariusz oceny wyjściowej:

   1.1 Ocena cech socjodemograficznych, zebranie szczegółowego wywiadu i innych znanych czynników ryzyka (higiena jamy ustnej…), budowa rodowodu rodziny do trzech pokoleń w celu zdiagnozowania ryzyka genetycznych i rodzinnych przyczyn NAFLD i NASH 1.2 Ocena żywieniowa i behawioralna diety z pomiarami antropometrycznymi z wykorzystaniem kwestionariusza oceny wskaźnika jakości diety, spożycia napojów

2. W tym badaniu zostaną zbadane biomarkery multiomiczne we krwi i żywych organizmach. Podejście opiera się na wykrywaniu nowych patogenez molekularnych i nowych genów do odkrywania związanych z Egiptem biomarkerów badanych markerów multiomicznych.

   2.1 Próbki krwi: genomika

   2.1.1.1 Wykrywanie genów zaangażowanych w dyslipidemię: identyfikacja funkcjonalnego wariantu (wariantów) odpowiedzialnego za dyslipidemię przy użyciu paneli sekwencjonowania nowej generacji (NGS) głównych genów dyslipidemii; (LDLR), (APOB), (PCSK9) i (LDLRAP). Ta technika może pomóc nam zidentyfikować nowe warianty związane z dyslipidemią i te związane powszechnie z populacją egipską. Zostanie to zastosowane do 30 uczestników, u których zdiagnozowano dyslipidemię.

   2.1.1.2 Wykrywanie polimorfizmu genów dla NAFLD i NASH za pomocą testu „TaqMan SNP Genotyping Assay” dla całego genomu zidentyfikowanego wcześniej w analizach całego genomu jako powiązanego z NAFLD/NASH (do zweryfikowania wśród populacji egipskiej) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424 od wszystkich uczestników

   • DNA zostanie wyekstrahowane z krwi obwodowej przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA dostarczonego przez firmę Qiagen, USA przy użyciu Nanodropper 2000 (ThermoScientific).
   • Genotypowanie SNP zostanie przeprowadzone przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym Roche (light cycler 480) z testem dyskryminacji alleli TaqMan (Applied Biosystems, USA).

   2.1.2 Epigenomika Profilowanie ekspresji mikroRNA osocza

   • Analiza ekspresji 5 najlepszych miRNA: 5 najlepszych zmienionych miRNA zostanie wybranych do analizy u wszystkich pacjentów i kontroli metodą PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu zestawu rtęciowego LNA SYBR Green PCR (Qiagen). Krotność zmiany miRNA zostanie obliczona metodą 2-∆Ct.

   2.1.3 Glikoproteomika: identyfikacja wzorca glikozylacji transferyna, apolipoproteina C III (apoC III), haptoglobina, białko wiążące Mac2, IgG (Santa Cruz, USA). T

   2.2 Próbki śliny: 2.2.1 Metabolomika śliny 2.2.2 Identyfikacja metabolitów za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrem masowym (GC-MS) Analiza: ocena stężenia pięciu najważniejszych zidentyfikowanych metabolitów związanych z drobnoustrojami (które będą obecne w co najmniej 85% próbki) jako biomarkery metabolomiczne wśród wszystkich uczestników zostaną zbadane przy użyciu analizy GC-MS.

   2.2.3 Analiza predykcyjna niektórych znanych funkcji metagenomicznych. U wszystkich uczestników zostanie określone stężenie laktoferyny, lipopolisacharydu (LPS) i immunoglobuliny A (IgA) w ślinie.

3. Modyfikacja zachowania poprzez indywidualne doradztwo