Omics-baserede forudsigere af NAFLD/potentielle NASH

Det nationale behandlingsprogram, der skulle give en kur til egyptiske HCV-inficerede patienter, var det gnistrende lys mod en HCV-fri og sund lever blandt den egyptiske befolkning. En anden hurtigt udviklende leversygdom er dog dukket op med en stigning i både dødelighed og sygelighed og en estimeret prævalens på 25-35% over hele kloden; ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD). Den højeste andel af NAFLD er rapporteret fra Mellemøsten (32%). Forekomsten af ​​NAFLD i den generelle befolkning stiger med alderen; fra 3 % hos børn, 5 % hos teenagere, 18 % mellem 20 og 40 år, 39 % hos dem i alderen 40 til 50 år og til over 40 % hos dem, der er over 70 år.

NAFLD er en metabolisk lidelse, hvis spektrum udvikler sig fra simpel steatose til ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH) og leverfibrose, hvilket potentielt kan føre til cirrose, hepatocellulært karcinom og leversvigt. Derfor betragtes NASH som en alvorlig form for NAFLD. I betragtning af sammenhængen mellem NAFLD og de voksende globale epidemier af fedme, type 2-diabetes, stillesiddende livsstil, dyslipidæmi og usunde kostmønstre, forventes udbredelsen af ​​NAFLD at stige. Derfor er NAFLD en stor klinisk og økonomisk belastning for verdens sundhedssystemer.

Selvom leverbiopsi er referencestandarden for vurdering af fibrose forbundet med NASH, har de iboende begrænsninger af en invasiv procedure og behovet for gentagen prøvetagning ført til udviklingen af ​​adskillige ikke-invasive tests (NIT'er) som alternativer til leverbiopsier . De nuværende NIT'er blev brugt til diagnosticering af fremskreden fibrose hos patienter med NAFLD (5). Sådanne NIT'er omfatter for det meste biologiske (serumbiomarkøralgoritmer) eller fysiske (billeddannende vurdering af vævsstivhed) vurderinger. Imidlertid har de nuværende tilgængelige NIT'er flere begrænsninger, såsom variabilitet, utilstrækkelig nøjagtighed og risikofaktorer for fejl. De nuværende NIT'er blev brugt ikke kun til at diagnosticere signifikant fibrose ved kronisk hepatitis C, men også til diagnosticering af fremskreden fibrose hos patienter med NAFLD/NASH.

I lande med lav ressource, på trods af den høje forekomst af NAFLD, og ​​at dets tidlige stadier er reversible med kost- og livsstilsændringer, er tilgængeligheden af ​​NIT'er sandsynligvis begrænset, især de dyrere billeddannelsesbaserede tests. Blodbaserede biomarkører er derfor attraktive, men de, der er tilgængelige til dato, har kun moderat diagnostisk nøjagtighed. Desuden er kun et mindretal af NAFLD-tilfælde diagnosticeret og korrekt behandlet, da opdagelse af tidlige stadier hindres af mangel på ikke-invasive pålidelige og validerede metoder til tidlig diagnose. Derudover er der få muligheder for håndtering af NASH og ingen nuværende FDA-godkendte behandlinger til NAFLD.

Til dato er patogenesen af ​​NAFLD ikke fuldstændig afklaret. NAFLD menes at være involveret i komplekse interaktioner mellem kost, genetisk modtagelighed og tarmmikrobiota (6). Samtidig har rollen som tarmmikrobiota og mikrobielle metabolitter i NAFLD tiltrukket sig mere opmærksomhed. Tarmmikrobiota regulerer udviklingen og progressionen af ​​NAFLD på basis af tarm-lever-aksen. Fremtidige målrettede behandlingsstrategier baseret på de patogene veje er derfor nødvendige for at udvikle en effektiv behandling til patienter med NASH.

I store træk kaldes de videnskabelige felter, der er forbundet med at måle de biologiske molekyler på en high-throughput måde "omics". Selvom igangværende teknologiske fremskridt inden for omics-teknologier såsom genomics, proteomics og metabolomics har store løfter for opdagelsen af ​​nyttige ikke-invasive biomarkører og øget patofysiologisk forståelse af NAFLD- og NASH-diagnose, prognose og lægemiddelrespons. De fleste anvendte én omics-teknik. Fremskridt inden for human genetik giver nye muligheder for at imødekomme det presserende behov for NASH-terapi baseret på en forbedret forståelse af samspillet mellem de genetiske og miljømæssige risikofaktorer for udviklingen af ​​NASH. MikroRNA'er (miRNA'er blev rapporteret at være tæt relateret til NAFLD ved at målrette gener involveret i lipidmetabolisme og pro-inflammatoriske faktorer, der er relateret til patogenesen af ​​NAFLD. Derudover er mange glycoproteiner blevet forbundet med diagnosen af ​​leversygdomme, da størstedelen af ​​serumglycoproteiner syntetiseres i leveren. Desværre har nogle få banebrydende undersøgelser med succes anvendt multi-omics-teknologier til at undersøge NAFLD/NASH, hvoraf ingen blev udført blandt den egyptiske befolkning.

Efterforskerne havde til formål at udvikle et multi-omics sammensat prædiktivt biomarkørpanel, der skulle bruges som et egyptisk scoringssystem for at forbedre den forudsigelige kraft af diagnosen NAFLD og begrænse dens progression til NASH sammenlignet med de traditionelle markører, der normalt fokuserer på et enkelt aspekt af sygdommen. Sådanne prædiktive biomarkører kan også gavne den kliniske håndtering af NAFLD for at begrænse dens progression til NASH.

Specifikke mål:

1. At identificere de funktionelle varianter, der forårsager dyslipidæmi og dens forårsagende gener mutation på en delprøve af deltagere (30 patienter) ved hjælp af næste generations sekventering (NGS).
2. For at identificere og verificere de mest betydningsfulde 10 gener (tidligere identificeret som associeret med NAFLD/NASH i genom-dækkende analyser) blandt den egyptiske befolkning: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL112A177KRs, 8012NC175, 8001 7001 8001 7001 7001 7001 7001 7001 7001 7001 7001 8001 8001 8001 1001 rs, 7001 rs, 7001 rs, 7001 rs, 7001 rs, 7001 rs, 7001 rs, 7001 rs, 7001 rs, 7001 rs, 7001 rs, 7001 rs, 7001 rs. , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 og MTTP rs1800591 ved hjælp af TaqMan SNP Genotyping Assay
3. At skitsere den mulige sammenhæng mellem genetiske variationer med den aktuelt anvendte behandling for NAFLD med og uden fibrose (f.eks. E-vitamin, C-vitamin, D-vitamin; metformin til børn og pioglitazon til voksne...)
4. For at identificere ekspressionsniveauet af plasma miRNA'er (de 5 øverste af 168-panelgener af plasma miRNA'er) ved PCR-array ifølge de undersøgte grupper
5. At vurdere potentialet for ændret miRNAs ekspressionsprofil forbundet med aktuelt brugt lægemiddel til behandling af NAFLD uden eller med fibrose.
6. For at identificere glykosyleringsprofilen af ​​både N- og O-glykoproteiner viste sig at være forbundet med NAFLD/NASH (transferrin, apolipoprotein C III (apoC III), haptoglobin, Mac2-bindende protein, IgG) -) blandt egyptiske patienter med NAFLD uden eller med fibrose
7. At vurdere forholdet mellem glykosyleringsmønsteret af de undersøgte glycoproteiner som respons på det aktuelt anvendte lægemiddel til NAFLD MED OG UDEN FIBROSIS behandling.
8. At identificere de bakterielle isolater blandt de egyptiske populationer, der er knyttet til NAFLD-patienter uden og med fibrose og kontroller (ud af 10 bakterieisolater) ved hjælp af -Rapid RT-PCR-test til 16S rRNA gen amplikon bibliotek forberedelse og sekventering
9. At identificere de top fem spytpåviste mikrobiom-relaterede metabolitter ved at sammenligne deres koncentrationer for NAFLD uden og med fibrose og kontrol ved hjælp af gaskromatografi-massespektrometer (GC-MS) analyse
10. At vurdere sammenhængen mellem nogle kendte meta-genomiske funktioner ved hjælp af kommercielle ELISA-kits. (spytkoncentrationer af lactoferrin, lipopolysaccharid og immunoglobulin A til påvisning af NAFLD uden og med fibrose.
11. For at bestemme om kombinationer af de påviste spytmetabolitter kunne bruges som en biomarkørsignatur til påvisning af NAFLD uden og med fibrose.
12. At identificere interaktionen og indflydelsen af ​​den epidemiologiske, diætetiske livsstil på de undersøgte multi-omics biomarkører og på den kliniske præsentation af NAFLD uden og med fibrose.

Forskningsmetodik og værktøjer

Denne undersøgelse er en tværsnitsundersøgelse udført med 24 måneders værktøjer:

1. Grundlæggende vurderingsspørgeskema:

   1.1 Vurdering af de sociodemografiske karakteristika, detaljeret historieoptagelse og andre kendte risikofaktorer (mundhygiejne...), familie stamtavle konstruktion op til tre generationer for at diagnosticere risikoen for genetiske og familiære årsager til NAFLD og NASH 1.2 Ernærings- og diætadfærdsvurdering med antropometriske målinger ved hjælp af kostkvalitetsindeksvurderingsspørgeskema, drikkevareindtag

2. Multi-omics biomarkører i blod og levende vil blive undersøgt i denne undersøgelse. Tilgangen er baseret på at detektere nye molekylære patogeneser og nye gener til at opdage egyptisk-relaterede biomarkører af de undersøgte multi-omics markører.

   2.1 Blodprøver: Genomik

   2.1.1.1 Påvisning af gener involveret i dyslipidæmi: Identifikation af funktionel(e) variant(er), der er ansvarlig for dyslipidæmi ved hjælp af næste generations sekventeringspaneler (NGS) af dyslipidæmi-hovedgener; (LDLR), (APOB), (PCSK9) og (LDLRAP). Denne teknik kan hjælpe os med at identificere nye dyslipidæmi-relaterede varianter og dem, der almindeligvis er relateret til den egyptiske befolkning. Dette vil blive anvendt på 30 deltagere kun diagnosticeret med dyslipidæmi.

   2.1.1.2 Påvisning af genpolymorfi for NAFLD og NASH ved "TaqMan SNP Genotyping Assay" for hele genomet, der tidligere er identificeret i genomomfattende analyser, der skal kobles til NAFLD/NASH (skal verificeres blandt den egyptiske befolkning) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006445rs, FNPLA3 rs6006445rs , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 og 81MT05rs fra alle deltagere

   • DNA vil blive ekstraheret fra det perifere blod ved hjælp af et DNA-ekstraktionssæt leveret af Qiagen, USA ved hjælp af Nanodropper 2000 (ThermoScientific).
   • SNP Genotyping vil blive udført ved hjælp af Roches realtids-PCR-system (light cycler 480) med TaqMan alleldiskrimineringsassay (Applied Biosystems, USA).

   2.1.2 Epi-genomics Ekspressionsprofilering af plasma mikroRNA'er

   • Ekspressionsanalyse af top 5 miRNA'er: Top 5 ændrede miRNA'er vil blive udvalgt til at blive analyseret i alle patienter og kontroller ved real-time PCR ved hjælp af kviksølv LNA SYBR Green PCR kit (Qiagen). Foldændring af miRNA vil blive beregnet ved hjælp af 2-∆Ct-metoden.

   2.1.3 Glycoproteomics: identifikation af glycosyleringsmønsteret transferrin, apolipoprotein C III (apoC III), haptoglobin, Mac2 bindende protein, IgG (Santa Cruz, USA). T

   2.2 Spytprøver: 2.2.1 Spytmetabolomik 2.2.2 Metabolitteridentifikation ved hjælp af gaskromatografi-massespektrometer (GC-MS) Analyse: vurdering af koncentrationen af ​​de fem øverste identificerede mikrobielle-relaterede metabolitter (som findes i mindst 85 % af prøver) som metabolomiske biomarkører blandt alle deltagere vil blive undersøgt ved hjælp af GC-MS-analyse.

   2.2.3 Prædiktiv analyse af nogle kendte meta-genomiske funktioner. Spytkoncentrationerne af lactoferrin, lipopolysaccharid (LPS) og immunglobulin A (IgA) vil blive bestemt for alle deltagere.

3. Adfærdsændring gennem individuel rådgivning