Preditores baseados em ômicas de NAFLD/Potencial NASH

O programa nacional de tratamento destinado a fornecer uma cura para os pacientes egípcios infectados pelo HCV foi a luz para um fígado saudável e livre do HCV entre a população egípcia. No entanto, outra doença hepática de evolução rápida tem surgido com um aumento tanto na mortalidade quanto na morbidade, e uma prevalência estimada de 25-35% em todo o mundo; doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA). A maior taxa de NAFLD é relatada no Oriente Médio (32%). A prevalência de DHGNA na população em geral aumenta com a idade; de 3% em crianças, 5% em adolescentes, 18% entre 20 e 40 anos, 39% entre 40 e 50 anos e acima de 40% em maiores de 70 anos.

DHGNA é um distúrbio metabólico, cujo espectro progride de esteatose simples para esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e fibrose hepática, levando potencialmente a cirrose, carcinoma hepatocelular e insuficiência hepática. Consequentemente, a NASH é considerada uma forma grave de DHGNA. Dada a associação entre DHGNA e a crescente epidemia global de obesidade, diabetes tipo 2, estilos de vida sedentários, dislipidemia e padrões alimentares pouco saudáveis, espera-se que a prevalência de DHGNA aumente. Portanto, NAFLD é um grande fardo clínico e econômico nos sistemas de saúde do mundo.

Embora a biópsia hepática seja o padrão de referência para a avaliação da fibrose associada à NASH, as limitações inerentes de um procedimento invasivo e a necessidade de repetição da amostragem levaram ao desenvolvimento de vários testes não invasivos (NITs) como alternativas à biópsia hepática . Os NITs atuais foram usados ​​para o diagnóstico de fibrose avançada em pacientes com DHGNA (5). Esses NITs incluem principalmente avaliações biológicas (algoritmos de biomarcadores séricos) ou físicas (avaliação por imagem da rigidez tecidual). No entanto, os NITs atualmente disponíveis apresentam várias limitações, como variabilidade, precisão inadequada e fatores de risco para erro. Os NITs atuais foram usados ​​não apenas para diagnosticar fibrose significativa na hepatite C crônica, mas também para o diagnóstico de fibrose avançada em pacientes com DHGNA/NASH.

Em países com poucos recursos, apesar da alta prevalência de DHGNA e de seus estágios iniciais serem reversíveis com modificações na dieta e no estilo de vida, é provável que a disponibilidade de NITs seja limitada, especialmente os exames de imagem mais caros. Os biomarcadores baseados no sangue são, portanto, atraentes, mas os disponíveis até o momento têm precisão diagnóstica apenas moderada. Além disso, apenas uma minoria dos casos de NAFLD é diagnosticada e tratada corretamente, pois a detecção de estágios iniciais é prejudicada pela falta de métodos não invasivos confiáveis ​​e validados de diagnóstico precoce. Além disso, existem poucas opções disponíveis para o manejo da NASH e nenhuma terapia atual aprovada pela FDA para NAFLD.

Até o momento, a patogênese da DHGNA não está totalmente esclarecida. Acredita-se que a DHGNA esteja envolvida em interações complexas entre dieta, suscetibilidade genética e microbiota intestinal (6). Ao mesmo tempo, o papel da microbiota intestinal e dos metabólitos microbianos na DHGNA atraiu mais atenção. A microbiota intestinal regula o desenvolvimento e a progressão da DHGNA com base no eixo intestino-fígado. Futuras estratégias de tratamento direcionadas com base nas vias patogênicas são necessárias para desenvolver um tratamento eficaz para pacientes com NASH.

De um modo geral, os campos científicos associados à medição de moléculas biológicas de maneira de alto rendimento são chamados de "ômicas". No entanto, os avanços tecnológicos em andamento nas tecnologias ômicas, como genômica, proteômica e metabolômica, são uma grande promessa para a descoberta de biomarcadores não invasivos úteis e maior compreensão fisiopatológica do diagnóstico, prognóstico e resposta a medicamentos de NAFLD e NASH. A maioria aplicou uma técnica ômica. Os avanços na genética humana apresentam novas oportunidades para abordar a necessidade urgente de terapia NASH, com base em uma melhor compreensão da interação entre os fatores de risco genéticos e ambientais para o desenvolvimento de NASH. MicroRNAs (miRNAs foram relatados como intimamente relacionados à DHGNA, visando genes envolvidos no metabolismo lipídico e fatores pró-inflamatórios relacionados à patogênese da DHGNA. Além disso, muitas glicoproteínas têm sido associadas ao diagnóstico de distúrbios hepáticos, uma vez que a maioria das glicoproteínas séricas é sintetizada no fígado. Infelizmente, alguns estudos pioneiros aplicaram com sucesso tecnologias multiômicas para investigar NAFLD/NASH, nenhum dos quais foi feito entre a população egípcia.

Os pesquisadores pretendiam desenvolver um painel de biomarcadores preditivos composto multi-ômico para ser usado como um sistema de pontuação egípcio para melhorar o poder preditivo do diagnóstico de DHGNA e limitar sua progressão para NASH, em comparação com os marcadores tradicionais que geralmente se concentram em um único aspecto da doença. Esses biomarcadores preditivos também podem beneficiar o manejo clínico da NAFLD para limitar sua progressão para NASH.

Objetivos específicos:

1. Identificar as variantes funcionais que causam dislipidemia e a mutação de seus genes causadores em uma subamostra de participantes (30 pacientes) usando sequenciamento de próxima geração (NGS).
2. Identificar e verificar os 10 genes mais significativos (anteriormente identificados como associados à NAFLD/NASH em análises genômicas amplas) entre a população egípcia: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs121 370GCR 4 rs , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 e MTTP rs1800591 usando o ensaio de genotipagem TaqMan SNP
3. Descrever a possível associação de variações genéticas com o tratamento atualmente utilizado para NAFLD com e sem fibrose (por exemplo, vitamina E, vitamina C, vitamina D; metformina para crianças e pioglitazona para adultos…)
4. Identificar o nível de expressão de miRNAs plasmáticos (os 5 principais de 168 genes de painel de miRNAs plasmáticos) por PCR array de acordo com os grupos estudados
5. Avaliar o potencial do perfil de expressão de miRNAs alterado associado à droga atualmente utilizada para o tratamento da DHGNA sem ou com fibrose.
6. Para identificar o perfil de glicosilação de N- e O-glicoproteínas comprovadamente ligadas a NAFLD/NASH (transferrina, apolipoproteína C III (apoC III), haptoglobina, proteína de ligação a Mac2, IgG) -) entre pacientes egípcios com NAFLD sem ou com fibrose
7. Avaliar a relação entre o padrão de glicosilação das glicoproteínas estudadas em resposta à droga atualmente utilizada para o tratamento da DHGNA COM E SEM FIBROSE.
8. Identificar os isolados bacterianos entre as populações egípcias que estão ligados a pacientes com DHGNA sem e com fibrose e controles (de 10 isolados bacterianos) usando o teste -Rapid RT-PCR para preparação e sequenciamento da biblioteca de amplicon do gene 16S rRNA
9. Identificar os cinco principais metabólitos relacionados ao microbioma detectados na saliva, comparando suas concentrações para DHGNA sem e com fibrose e controle usando análise por cromatografia gasosa-espectrômetro de massa (GC-MS)
10. Avaliar a associação de algumas funções metagenômicas conhecidas usando kits ELISA comerciais. (concentrações salivares de lactoferrina, lipopolissacarídeo e imunoglobulina A para detectar DHGNA sem e com fibrose.
11. Determinar se as combinações dos metabólitos salivares detectados podem ser usadas como uma assinatura de biomarcador para detectar NAFLD sem e com fibrose.
12. Identificar a interação e influência dos fatores epidemiológicos, dietéticos e de estilo de vida nos biomarcadores multiômicos estudados e na apresentação clínica da DHGNA sem e com fibrose.

Metodologia e ferramentas de pesquisa

Este estudo é um estudo exploratório transversal realizado ao longo de 24 meses de ferramentas:

1. Questionário de avaliação de linha de base:

   1.1 Avaliação das características sociodemográficas, anamnese detalhada e outros fatores de risco conhecidos (higiene bucal….), construção de pedigree familiar até três gerações para diagnosticar o risco de causas genéticas e familiares para NAFLD e NASH 1.2 Avaliação nutricional e comportamental dietética com medidas antropométricas usando questionário de avaliação do índice de qualidade da dieta, ingestão de bebidas

2. Biomarcadores multi-ômicos em sangue e vivo serão investigados neste estudo. A abordagem é baseada na detecção de novas patogêneses moleculares e novos genes para descobrir biomarcadores egípcios dos marcadores multi-ômicos estudados.

   2.1 Amostras de sangue: Genômica

   2.1.1.1 Detecção de genes envolvidos na dislipidemia: Identificação da(s) variante(s) funcional(is) responsável(is) pela dislipidemia usando painéis de sequenciamento de nova geração (NGS) dos principais genes da dislipidemia; (LDLR), (APOB), (PCSK9) e (LDLRAP). Essa técnica pode nos ajudar a identificar novas variantes relacionadas à dislipidemia e aquelas relacionadas comumente à população egípcia. Isso será aplicado a 30 participantes diagnosticados apenas com dislipidemia.

   2.1.1.2 Detecção de polimorfismo genético para NAFLD e NASH por "TaqMan SNP Genotyping Assay" para todo o genoma previamente identificado em análises genômicas a serem ligadas a NAFLD/NASH (a ser verificado entre a população egípcia) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424 , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 e MTTP rs1800591: de todos os participantes

   • O DNA será extraído do sangue periférico usando um kit de extração de DNA fornecido pela Qiagen, EUA usando o Nanodropper 2000 (ThermoScientific).
   • A genotipagem de SNP será realizada utilizando o sistema de PCR em tempo real da Roche (light cycler 480) com ensaio de discriminação alélica TaqMan (Applied Biosystems, EUA).

   2.1.2 Perfil de expressão epigenômica de microRNAs plasmáticos

   • Análise de expressão dos 5 principais miRNAs: Os 5 principais miRNAs alterados serão selecionados para serem analisados ​​em todos os pacientes e controles por PCR em tempo real usando o kit Mercury LNA SYBR Green PCR (Qiagen). A mudança de dobramento do miRNA será calculada usando o método 2-∆Ct.

   2.1.3 Glicoproteômica: identificação do padrão de glicosilação transferrina, apolipoproteína C III (apoC III), haptoglobina, proteína de ligação a Mac2, IgG (Santa Cruz, EUA). T

   2.2 Amostras de saliva: 2.2.1 Metabolômica salivar 2.2.2 Identificação de metabólitos usando cromatografia gasosa-espectrômetro de massa (GC-MS) Análise: avaliando a concentração dos cinco principais metabólitos relacionados a micróbios identificados (que serão encontrados em pelo menos 85% dos amostras) como biomarcadores metabolômicos entre todos os participantes serão investigados usando análise GC-MS.

   2.2.3 Análise preditiva de algumas funções metagenómicas conhecidas. As concentrações salivares de lactoferrina, lipopolissacarídeo (LPS) e imunoglobulina A (IgA) serão determinadas para todos os participantes.

3. Modificação comportamental através de aconselhamento individual