Predictores basados ​​en ómicas de NAFLD/NASH potencial

El programa nacional de tratamiento destinado a proporcionar una cura para los pacientes egipcios infectados con el VHC fue la luz que encendió la luz hacia un hígado saludable y libre de VHC entre la población egipcia. Sin embargo, ha surgido otra enfermedad hepática de rápida evolución con un aumento tanto de la mortalidad como de la morbilidad, y una prevalencia estimada del 25-35% en todo el mundo; enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA). La tasa más alta de NAFLD se informa en el Medio Oriente (32%). La prevalencia de NAFLD en la población general aumenta con la edad; del 3% en niños, 5% en adolescentes, 18% entre 20 y 40 años, 39% en los de 40 a 50 años, y más del 40% en los mayores de 70 años.

NAFLD es un trastorno metabólico, cuyo espectro progresa desde la esteatosis simple hasta la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y la fibrosis hepática, lo que puede conducir a cirrosis, carcinoma hepatocelular e insuficiencia hepática. En consecuencia, NASH se considera una forma grave de NAFLD. Dada la asociación entre NAFLD y las crecientes epidemias mundiales de obesidad, diabetes tipo 2, estilos de vida sedentarios, dislipidemia y patrones dietéticos poco saludables, se espera que aumente la prevalencia de NAFLD. Por lo tanto, NAFLD es una carga clínica y económica importante para los sistemas de salud del mundo.

Aunque la biopsia hepática es el estándar de referencia para la evaluación de la fibrosis asociada con NASH, las limitaciones inherentes de un procedimiento invasivo y la necesidad de repetir el muestreo han llevado al desarrollo de varias pruebas no invasivas (NIT) como alternativas a la biopsia hepática. . Las NIT actuales se utilizaron para el diagnóstico de fibrosis avanzada en pacientes con NAFLD (5). Dichas NIT incluyen principalmente evaluaciones biológicas (algoritmos de biomarcadores séricos) o físicas (evaluación por imágenes de la rigidez del tejido). Sin embargo, las NIT actualmente disponibles tienen varias limitaciones, como la variabilidad, la precisión inadecuada y los factores de riesgo de error. Las NIT actuales se utilizaron no solo para diagnosticar fibrosis significativa en la hepatitis C crónica, sino también para el diagnóstico de fibrosis avanzada en pacientes con NAFLD/NASH.

En los países de bajos recursos, a pesar de la alta prevalencia de NAFLD y de que sus etapas iniciales son reversibles con modificaciones en la dieta y el estilo de vida, es probable que la disponibilidad de NIT sea limitada, especialmente las pruebas más costosas basadas en imágenes. Por lo tanto, los biomarcadores basados ​​en sangre son atractivos, pero los disponibles hasta la fecha solo tienen una precisión diagnóstica moderada. Además, solo una minoría de los casos de NAFLD se diagnostican y tratan correctamente, ya que la detección de etapas tempranas se ve obstaculizada por la falta de métodos no invasivos confiables y validados de diagnóstico temprano. Además, hay pocas opciones disponibles para el manejo de NASH y no hay terapias actuales aprobadas por la FDA para NAFLD.

Hasta la fecha, la patogénesis de NAFLD no está completamente aclarada. Se cree que NAFLD está involucrado en interacciones complejas entre la dieta, la susceptibilidad genética y la microbiota intestinal (6). Al mismo tiempo, el papel de la microbiota intestinal y los metabolitos microbianos en NAFLD ha atraído más atención. La microbiota intestinal regula el desarrollo y la progresión de NAFLD sobre la base del eje intestino-hígado. En consecuencia, se necesitan futuras estrategias de tratamiento específicas basadas en las vías patogénicas para desarrollar un tratamiento eficaz para los pacientes con EHNA.

En términos generales, los campos científicos asociados con la medición de moléculas biológicas de una manera de alto rendimiento se denominan "ómicas". Sin embargo, los avances tecnológicos en curso en las tecnologías ómicas, como la genómica, la proteómica y la metabolómica, son muy prometedores para el descubrimiento de biomarcadores no invasivos útiles y una mayor comprensión fisiopatológica del diagnóstico, el pronóstico y la respuesta farmacológica de NAFLD y NASH. La mayoría aplicó una técnica ómica. Los avances en la genética humana presentan nuevas oportunidades para abordar la necesidad urgente de tratamientos para la NASH, basados ​​en una mejor comprensión de la interacción entre los factores de riesgo genéticos y ambientales para el desarrollo de la NASH. Los microARN (se informó que los miARN están estrechamente relacionados con la NAFLD al dirigirse a los genes involucrados en el metabolismo de los lípidos y los factores proinflamatorios que están relacionados con la patogénesis de la NAFLD. Además, muchas glicoproteínas se han relacionado con el diagnóstico de trastornos hepáticos dado que la mayoría de las glicoproteínas séricas se sintetizan en el hígado. Desafortunadamente, algunos estudios pioneros han aplicado con éxito tecnologías multiómicas para investigar NAFLD/NASH, ninguno de los cuales se realizó entre la población egipcia.

El objetivo de los investigadores era desarrollar un panel de biomarcadores predictivos compuestos multiómicos que se usaría como un sistema de puntuación egipcio para mejorar el poder predictivo del diagnóstico de NAFLD y limitar su progresión a NASH, en comparación con los marcadores tradicionales que generalmente se enfocan en un solo aspecto. de la enfermedad Dichos biomarcadores predictivos también pueden beneficiar el manejo clínico de NAFLD para limitar su progresión a NASH.

Objetivos específicos:

1. Identificar las variantes funcionales causantes de la dislipidemia y la mutación de sus genes causales en una submuestra de participantes (30 pacientes) mediante secuenciación de próxima generación (NGS).
2. Identificar y verificar los 10 genes más significativos (anteriormente identificados como asociados con NAFLD/NASH en análisis de genoma completo) entre la población egipcia: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs704, G9CK , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 y MTTP rs1800591 usando el ensayo de genotipado TaqMan SNP
3. Delinear la posible asociación de variaciones genéticas con el tratamiento utilizado actualmente para NAFLD con y sin fibrosis (por ejemplo, vitamina E, vitamina C, vitamina D; metformina para niños y pioglitazona para adultos...)
4. Identificar el nivel de expresión de los miARN plasmáticos (los 5 mejores genes de 168 paneles de miARN plasmáticos) mediante matriz de PCR según los grupos estudiados
5. Evaluar el potencial del perfil de expresión de miARN alterado asociado con el fármaco utilizado actualmente para el tratamiento de NAFLD sin o con fibrosis.
6. Identificar el perfil de glicosilación de las glicoproteínas N y O que se demostró que están relacionadas con NAFLD/NASH (transferrina, apolipoproteína C III (apoC III), haptoglobina, proteína de unión a Mac2, IgG) -) entre pacientes egipcios con NAFLD sin o con fibrosis
7. Evaluar la relación entre el patrón de glicosilación de las glicoproteínas estudiadas en respuesta al fármaco utilizado actualmente para el tratamiento de NAFLD CON Y SIN FIBROSIS.
8. Identificar los aislados bacterianos entre las poblaciones egipcias que están vinculados a pacientes con NAFLD sin y con fibrosis y controles (de 10 aislados bacterianos) utilizando la prueba Rapid RT-PCR para la preparación y secuenciación de la biblioteca de amplicones del gen 16S rRNA
9. Identificar los cinco principales metabolitos relacionados con el microbioma detectados en la saliva mediante la comparación de sus concentraciones para NAFLD sin y con fibrosis y el control mediante el análisis de cromatografía de gases-espectrómetro de masas (GC-MS)
10. Evaluar la asociación de algunas funciones meta-genómicas conocidas utilizando kits ELISA comerciales. (concentraciones en saliva de lactoferrina, lipopolisacárido e inmunoglobulina A para detectar NAFLD sin y con fibrosis.
11. Determinar si las combinaciones de los metabolitos salivales detectados podrían usarse como una firma de biomarcador para detectar NAFLD sin y con fibrosis.
12. Identificar la interacción e influencia del estilo de vida epidemiológico, dietético, sobre los biomarcadores multiómicos estudiados y sobre la presentación clínica de NAFLD sin y con fibrosis.

Metodología y herramientas de investigación

Este estudio es un estudio transversal exploratorio realizado a lo largo de 24 meses herramientas:

1. Cuestionario de evaluación inicial:

   1.1 Valoración de las características sociodemográficas, anamnesis detallada y otros factores de riesgo conocidos (higiene bucal….), construcción del árbol genealógico familiar hasta tres generaciones para diagnosticar el riesgo de causas genéticas y familiares para NAFLD y NASH 1.2 Evaluación del comportamiento nutricional y dietético con mediciones antropométricas utilizando el cuestionario de evaluación del índice de calidad de la dieta, ingesta de bebidas

2. En este estudio se investigarán biomarcadores multiómicos en sangre y vivos. El enfoque se basa en la detección de nuevas patogenias moleculares y nuevos genes para descubrir biomarcadores relacionados con Egipto de los marcadores multiómicos estudiados.

   2.1 Muestras de sangre: Genómica

   2.1.1.1 Detección de genes implicados en la dislipidemia: identificación de variantes funcionales que son responsables de la dislipidemia utilizando paneles de secuenciación de próxima generación (NGS) de los genes principales de la dislipidemia; (LDLR), (APOB), (PCSK9) y (LDLRAP). Esta técnica puede ayudarnos a identificar nuevas variantes relacionadas con la dislipidemia y aquellas relacionadas comúnmente con la población egipcia. Esto se aplicará a 30 participantes solo diagnosticados de dislipidemia.

   2.1.1.2 Detección de polimorfismo génico para NAFLD y NASH mediante el "ensayo de genotipado TaqMan SNP" para todo el genoma previamente identificado en análisis de genoma completo para vincularlo con NAFLD/NASH (a verificar entre la población egipcia) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424 , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 y MTTP rs1800591: de todos los participantes

   • El ADN se extraerá de la sangre periférica utilizando un kit de extracción de ADN suministrado por Qiagen, EE. UU. utilizando Nanodropper 2000 (ThermoScientific).
   • El genotipado de SNP se realizará utilizando el sistema de PCR en tiempo real de Roche (lightcycler 480) con el ensayo de discriminación alélica TaqMan (Applied Biosystems, EE. UU.).

   2.1.2 Perfiles de expresión epigenómica de microARN plasmáticos

   • Análisis de expresión de los 5 miARN principales: se seleccionarán los 5 miARN alterados principales para analizarlos en todos los pacientes y controles mediante PCR en tiempo real utilizando el kit de PCR Mercury LNA SYBR Green (Qiagen). El cambio de pliegue de miARN se calculará utilizando el método de 2-∆Ct.

   2.1.3 Glicoproteómica: identificación del patrón de glicosilación transferrina, apolipoproteína C III (apoC III), haptoglobina, proteína de unión a Mac2, IgG (Santa Cruz, EE. UU.). T

   2.2 Muestras de saliva: 2.2.1 Metabolómica salival 2.2.2 Identificación de metabolitos mediante análisis de cromatografía de gases-espectrómetro de masas (GC-MS): evaluación de la concentración de los cinco metabolitos relacionados con microbios identificados (que se encontrarán en al menos el 85 % de muestras) como biomarcadores metabolómicos entre todos los participantes se investigarán mediante análisis GC-MS.

   2.2.3 Análisis predictivo de algunas funciones metagenómicas conocidas. Se determinarán las concentraciones salivales de lactoferrina, lipopolisacárido (LPS) e inmunoglobulina A (IgA) para todos los participantes.

3. Modificación del comportamiento a través de la consejería individual