Op Omics gebaseerde voorspellers van NAFLD/Potentiële NASH

Het nationale behandelingsprogramma dat bedoeld was om Egyptische HCV-geïnfecteerde patiënten te genezen, was het sprankelende licht op weg naar een HCV-vrije en gezonde lever onder de Egyptische bevolking. Er is echter een andere snel evoluerende leverziekte aan het opkomen met een toename van zowel mortaliteit als morbiditeit, en een geschatte prevalentie van 25-35% over de hele wereld; niet-alcoholische leververvetting (NAFLD). Het hoogste percentage NAFLD wordt gerapporteerd vanuit het Midden-Oosten (32%). De prevalentie van NAFLD in de algemene bevolking neemt toe met de leeftijd; van 3% bij kinderen, 5% bij tieners, 18% tussen 20 en 40 jaar, 39% bij mensen van 40 tot 50 jaar en tot meer dan 40% bij mensen ouder dan 70 jaar.

NAFLD is een stofwisselingsziekte, waarvan het spectrum zich ontwikkelt van eenvoudige steatose tot niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) en leverfibrose, mogelijk leidend tot cirrose, hepatocellulair carcinoom en leverfalen. Dienovereenkomstig wordt NASH beschouwd als een ernstige vorm van NAFLD. Gezien de associatie tussen NAFLD en de groeiende wereldwijde epidemieën van obesitas, diabetes type 2, zittende levensstijlen, dyslipidemie en ongezonde voedingspatronen, wordt verwacht dat de prevalentie van NAFLD zal toenemen. Daarom is NAFLD een grote klinische en economische last voor de gezondheidszorgsystemen in de wereld.

Hoewel leverbiopsie de referentiestandaard is voor de beoordeling van fibrose geassocieerd met NASH, hebben de inherente beperkingen van een invasieve procedure en de noodzaak van herhaalde bemonstering geleid tot de ontwikkeling van verschillende niet-invasieve tests (NIT's) als alternatieven voor leverbiopsie. . De huidige NIT's werden gebruikt voor de diagnose van gevorderde fibrose bij patiënten met NAFLD (5). Dergelijke NIT's omvatten meestal biologische (serum biomarker-algoritmen) of fysieke (beeldvormingsbeoordeling van weefselstijfheid) beoordelingen. De momenteel beschikbare NIT's hebben echter verschillende beperkingen, zoals variabiliteit, onvoldoende nauwkeurigheid en risicofactoren voor fouten. De huidige NIT's werden niet alleen gebruikt om significante fibrose bij chronische hepatitis C te diagnosticeren, maar ook voor de diagnose van gevorderde fibrose bij patiënten met NAFLD/NASH.

Ondanks de hoge prevalentie van NAFLD en het feit dat de vroege stadia ervan omkeerbaar zijn door veranderingen in het dieet en de levensstijl, is de beschikbaarheid van NIT's in landen met weinig middelen waarschijnlijk beperkt, vooral de duurdere op beeldvorming gebaseerde tests. Op bloed gebaseerde biomarkers zijn daarom aantrekkelijk, maar de tot nu toe beschikbare biomarkers hebben slechts een matige diagnostische nauwkeurigheid. Bovendien wordt slechts een minderheid van NAFLD-gevallen gediagnosticeerd en correct behandeld, aangezien het opsporen van vroege stadia wordt gehinderd door een gebrek aan niet-invasieve, betrouwbare en gevalideerde methoden voor vroege diagnose. Bovendien zijn er weinig opties beschikbaar voor het beheer van NASH en geen huidige door de FDA goedgekeurde therapieën voor NAFLD.

Tot op heden is de pathogenese van NAFLD niet volledig opgehelderd. NAFLD wordt verondersteld betrokken te zijn bij complexe interacties tussen voeding, genetische gevoeligheid en darmmicrobiota (6). Tegelijkertijd heeft de rol van darmmicrobiota en microbiële metabolieten in NAFLD meer aandacht getrokken. Darmmicrobiota reguleert de ontwikkeling en progressie van NAFLD op basis van de darm-leveras. Toekomstige gerichte behandelingsstrategieën op basis van de pathogene routes zijn daarom nodig om een ​​effectieve behandeling voor patiënten met NASH te ontwikkelen.

In grote lijnen worden de wetenschappelijke gebieden die verband houden met het op een high-throughput-manier meten van biologische moleculen "omics" genoemd. Hoewel de voortdurende technologische vooruitgang in omics-technologieën zoals genomics, proteomics en metabolomics veelbelovend is voor de ontdekking van bruikbare niet-invasieve biomarkers en een groter pathofysiologisch begrip van NAFLD- en NASH-diagnose, prognose en medicijnrespons. De meerderheid paste één omics-techniek toe. Vooruitgang in de menselijke genetica biedt nieuwe mogelijkheden om tegemoet te komen aan de dringende behoefte aan NASH-therapieën, gebaseerd op een beter begrip van de interactie tussen de genetische en omgevingsrisicofactoren voor de ontwikkeling van NASH. MicroRNA's (miRNA's waren naar verluidt nauw verwant aan NAFLD door zich te richten op genen die betrokken zijn bij het lipidenmetabolisme en pro-inflammatoire factoren die verband houden met de pathogenese van NAFLD. Bovendien zijn veel glycoproteïnen in verband gebracht met de diagnose van leveraandoeningen, aangezien de meeste serumglycoproteïnen in de lever worden gesynthetiseerd. Helaas hebben enkele baanbrekende onderzoeken met succes multi-omics-technologieën toegepast om NAFLD/NASH te onderzoeken, en geen daarvan is gedaan onder de Egyptische bevolking.

De onderzoekers streefden naar de ontwikkeling van een multi-omics samengesteld voorspellend biomarkerpaneel dat zou kunnen worden gebruikt als een Egyptisch scoresysteem om de voorspellende kracht van de diagnose van NAFLD te verbeteren en de progressie ervan tot NASH te beperken, vergeleken met de traditionele markers die zich meestal op een enkel aspect concentreren. van de ziekte. Dergelijke voorspellende biomarkers kunnen ook de klinische behandeling van NAFLD ten goede komen om de progressie naar NASH te beperken.

Specifieke doelen:

1. Identificeren van de functionele varianten die dyslipidemie veroorzaken en de veroorzakende genenmutatie op een subgroep van deelnemers (30 patiënten) met behulp van next-generation sequencing (NGS).
2. Om de 10 meest significante genen te identificeren en te verifiëren (eerder geïdentificeerd als geassocieerd met NAFLD / NASH in genoombrede analyses) onder de Egyptische bevolking: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137878, GC90KR 40KR rs12137878 , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 en MTTP rs1800591 met TaqMan SNP Genotyping Assay
3. Om de mogelijke associatie van genetische variaties met de momenteel gebruikte behandeling voor NAFLD met en zonder fibrose te schetsen (bijv. vitamine E, vitamine C, vitamine D; metformine voor kinderen en pioglitazon voor volwassenen...)
4. Om het expressieniveau van plasma-miRNA's (de top 5 van genen met 168 panelen van plasma-miRNA's) te identificeren door PCR-array volgens de bestudeerde groepen
5. Om het potentieel te beoordelen van een veranderd miRNA-expressieprofiel geassocieerd met het momenteel gebruikte medicijn voor de behandeling van NAFLD zonder of met fibrose.
6. Om het glycosyleringsprofiel van zowel N- als O-glycoproteïnen te identificeren, bleek het verband te houden met NAFLD/NASH (transferrine, apolipoproteïne C III (apoC III), haptoglobine, Mac2-bindend eiwit, IgG) -) bij Egyptische patiënten met NAFLD zonder of met fibrose
7. Om de relatie te beoordelen tussen het glycosyleringspatroon van de bestudeerde glycoproteïnen als reactie op het momenteel gebruikte medicijn voor NAFLD MET EN ZONDER FIBROSIS-behandeling.
8. Om de bacteriële isolaten te identificeren onder de Egyptische populaties die zijn gekoppeld aan NAFLD-patiënten zonder en met fibrose en controles (van de 10 bacteriële isolaten) met behulp van -Rapid RT-PCR-test voor voorbereiding en sequencing van 16S rRNA-gen-ampliconbibliotheek
9. Om de top vijf speeksel gedetecteerde microbioom-gerelateerde metabolieten te identificeren door hun concentraties te vergelijken voor NAFLD zonder en met fibrose en controle met behulp van gaschromatografie-massaspectrometer (GC-MS) analyse
10. Om de associatie van enkele bekende meta-genomische functies te beoordelen met behulp van commerciële ELISA-kits. (speekselconcentraties van lactoferrine, lipopolysaccharide en immunoglobuline A voor het detecteren van NAFLD zonder en met fibrose.
11. Om te bepalen of combinaties van de gedetecteerde speekselmetabolieten kunnen worden gebruikt als biomarkerhandtekening voor het detecteren van NAFLD zonder en met fibrose.
12. Identificeren van de interactie en invloed van de epidemiologische, voedings- en levensstijl op de bestudeerde multi-omics biomarkers en op de klinische presentatie van NAFLD zonder en met fibrose.

Onderzoeksmethodologie en hulpmiddelen

Deze studie is een cross-sectionele verkennende studie uitgevoerd langs 24 maanden tools:

1. Basislijn beoordelingsvragenlijst:

   1.1 Beoordeling van de sociodemografische kenmerken, gedetailleerde anamnese en andere bekende risicofactoren (mondhygiëne….), familie stamboom constructie tot drie generaties om het risico van genetische en familiale oorzaken voor NAFLD en NASH te diagnosticeren

2. In deze studie zullen multi-omics biomarkers in bloed en levend onderzocht worden. De aanpak is gebaseerd op het detecteren van nieuwe moleculaire pathogenese en nieuwe genen voor het ontdekken van Egyptisch-gerelateerde biomarkers van de bestudeerde multi-omics-markers.

   2.1 Bloedmonsters: Genomics

   2.1.1.1 Detectie van genen die betrokken zijn bij dyslipidemie: Identificatie van functionele variant(en) die verantwoordelijk zijn voor dyslipidemie met behulp van next-generation sequencing (NGS) panels van de hoofdgenen van dyslipidemie; (LDLR), (APOB), (PCSK9) en (LDLRAP). Deze techniek kan ons helpen bij het identificeren van nieuwe dyslipidemie-gerelateerde varianten en varianten die gewoonlijk verband houden met de Egyptische bevolking. Dit zal worden toegepast op 30 deelnemers met alleen de diagnose dyslipidemie.

   2.1.1.2 Detectie van genpolymorfisme voor NAFLD en NASH door "TaqMan SNP Genotyping Assay" voor het hele genoom dat eerder is geïdentificeerd in genoombrede analyses om te worden gekoppeld aan NAFLD / NASH (te verifiëren onder de Egyptische bevolking) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424 , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 en MTTP rs1800591: van alle deelnemers

   • DNA zal worden geëxtraheerd uit het perifere bloed met behulp van een DNA-extractiekit geleverd door Qiagen, de VS met behulp van Nanodropper 2000 (ThermoScientific).
   • SNP-genotypering zal worden uitgevoerd met behulp van het Roche real-time PCR-systeem (light cycler 480) met TaqMan allelische discriminatie-assay (Applied Biosystems, VS).

   2.1.2 Epi-genomics Expressieprofilering van plasma-microRNA's

   • Expressie-analyse van top 5 miRNA's: De top 5 gewijzigde miRNA's zullen worden geselecteerd om te worden geanalyseerd in alle patiënten en controles door middel van real-time PCR met behulp van kwik LNA SYBR Green PCR-kit (Qiagen). Vouwverandering van miRNA wordt berekend met behulp van de 2-∆Ct-methode.

   2.1.3 Glycoproteomics: identificatie van het glycosyleringspatroon transferrine, apolipoproteïne C III (apoC III), haptoglobine, Mac2-bindend eiwit, IgG (Santa Cruz, VS). T

   2.2 Speekselmonsters: 2.2.1 Speekselmetabolomica 2.2.2 Identificatie van metabolieten met behulp van gaschromatografie-massaspectrometeranalyse (GC-MS): beoordeling van de concentratie van de top vijf geïdentificeerde microbieel-gerelateerde metabolieten (die in ten minste 85% van de monsters) als metabolomics-biomarkers onder alle deelnemers zullen worden onderzocht met behulp van GC-MS-analyse.

   2.2.3 Voorspellende analyse van enkele bekende metagenoomfuncties. Van alle deelnemers worden de speekselconcentraties van lactoferrine, lipopolysaccharide (LPS) en immunoglobuline A (IgA) bepaald.

3. Gedragsverandering door individuele begeleiding