Omics-basierte Prädiktoren für NAFLD/Potential NASH

Das nationale Behandlungsprogramm mit dem Ziel, ägyptische HCV-infizierte Patienten zu heilen, war der Funke für eine HCV-freie und gesunde Leber in der ägyptischen Bevölkerung. Es ist jedoch eine andere sich schnell entwickelnde Lebererkrankung mit einem Anstieg sowohl der Mortalität als auch der Morbidität und einer geschätzten Prävalenz von 25-35 % auf der ganzen Welt aufgetreten; nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD). Die höchste NAFLD-Rate wird aus dem Nahen Osten gemeldet (32 %). Die Prävalenz von NAFLD in der Allgemeinbevölkerung nimmt mit dem Alter zu; von 3 % bei Kindern, 5 % bei Teenagern, 18 % zwischen 20 und 40 Jahren, 39 % bei Personen im Alter von 40 bis 50 Jahren und über 40 % bei Personen über 70 Jahren.

NAFLD ist eine Stoffwechselerkrankung, deren Spektrum von einfacher Steatose über nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) bis hin zu Leberfibrose reicht und möglicherweise zu Zirrhose, hepatozellulärem Karzinom und Leberversagen führt. Dementsprechend gilt NASH als schwere Form der NAFLD. Angesichts des Zusammenhangs zwischen NAFLD und den wachsenden globalen Epidemien von Fettleibigkeit, Typ-2-Diabetes, Bewegungsmangel, Dyslipidämie und ungesunden Ernährungsgewohnheiten wird erwartet, dass die Prävalenz von NAFLD zunehmen wird. Daher ist NAFLD eine große klinische und wirtschaftliche Belastung für die Gesundheitssysteme der Welt.

Obwohl die Leberbiopsie der Referenzstandard für die Beurteilung von Fibrose im Zusammenhang mit NASH ist, haben die inhärenten Einschränkungen eines invasiven Verfahrens und die Notwendigkeit wiederholter Probenentnahmen zur Entwicklung mehrerer nicht-invasiver Tests (NITs) als Alternativen zur Leberbiopsie geführt . Die aktuellen NITs wurden für die Diagnose einer fortgeschrittenen Fibrose bei Patienten mit NAFLD verwendet (5). Solche NITs umfassen meist biologische (Serum-Biomarker-Algorithmen) oder physikalische (bildgebende Beurteilung der Gewebesteifigkeit) Beurteilungen. Derzeit verfügbare NITs weisen jedoch mehrere Einschränkungen auf, wie z. B. Variabilität, unzureichende Genauigkeit und Risikofaktoren für Fehler. Die aktuellen NITs wurden nicht nur zur Diagnose einer signifikanten Fibrose bei chronischer Hepatitis C, sondern auch zur Diagnose einer fortgeschrittenen Fibrose bei Patienten mit NAFLD/NASH verwendet.

In Ländern mit geringen Ressourcen ist die Verfügbarkeit von NITs wahrscheinlich begrenzt, insbesondere trotz der hohen Prävalenz von NAFLD und der Tatsache, dass ihre frühen Stadien durch Änderungen der Ernährung und des Lebensstils reversibel sind, insbesondere der teureren bildgebenden Tests. Blutbasierte Biomarker sind daher attraktiv, aber die bisher verfügbaren haben nur eine mäßige diagnostische Genauigkeit. Darüber hinaus wird nur eine Minderheit der NAFLD-Fälle diagnostiziert und korrekt behandelt, da die Erkennung früher Stadien durch einen Mangel an nicht-invasiven, zuverlässigen und validierten Methoden zur Früherkennung behindert wird. Darüber hinaus gibt es nur wenige Optionen für das Management von NASH und keine aktuellen von der FDA zugelassenen Therapien für NAFLD.

Bis heute ist die Pathogenese der NAFLD nicht vollständig geklärt. Es wird angenommen, dass NAFLD an komplexen Wechselwirkungen zwischen Ernährung, genetischer Anfälligkeit und Darmmikrobiota beteiligt ist (6). Gleichzeitig hat die Rolle von Darmmikrobiota und mikrobiellen Metaboliten bei NAFLD mehr Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Die Darmmikrobiota reguliert die Entwicklung und das Fortschreiten von NAFLD auf der Grundlage der Darm-Leber-Achse. Zukünftige zielgerichtete Behandlungsstrategien, die auf den pathogenen Signalwegen basieren, sind dementsprechend erforderlich, um eine effektive Behandlung für Patienten mit NASH zu entwickeln.

Im Allgemeinen werden die wissenschaftlichen Bereiche, die mit der Hochdurchsatzmessung von biologischen Molekülen verbunden sind, als "Omics" bezeichnet. Die laufenden technologischen Fortschritte bei Omics-Technologien wie Genomik, Proteomik und Metabolomik sind jedoch vielversprechend für die Entdeckung nützlicher nicht-invasiver Biomarker und ein verbessertes pathophysiologisches Verständnis der NAFLD- und NASH-Diagnose, Prognose und Arzneimittelwirkung. Die Mehrheit wandte die One-Omics-Technik an. Fortschritte in der Humangenetik bieten neue Möglichkeiten, um den dringenden Bedarf an NASH-Therapeutika zu decken, basierend auf einem besseren Verständnis der Wechselwirkung zwischen den genetischen und umweltbedingten Risikofaktoren für die Entwicklung von NASH. MicroRNAs (miRNAs sollen eng mit NAFLD verwandt sein, indem sie auf Gene abzielen, die am Lipidstoffwechsel und entzündungsfördernden Faktoren beteiligt sind, die mit der Pathogenese von NAFLD zusammenhängen. Darüber hinaus wurden viele Glykoproteine ​​mit der Diagnose von Lebererkrankungen in Verbindung gebracht, da die meisten Serumglykoproteine ​​in der Leber synthetisiert werden. Leider haben einige bahnbrechende Studien Multi-Omics-Technologien erfolgreich angewendet, um NAFLD/NASH zu untersuchen, von denen keine in der ägyptischen Bevölkerung durchgeführt wurde.

Die Forscher zielten darauf ab, ein zusammengesetztes Multi-Omics-Biomarker-Panel zu entwickeln, das als ägyptisches Bewertungssystem verwendet werden soll, um die Vorhersagekraft der Diagnose von NAFLD zu verbessern und sein Fortschreiten zu NASH zu begrenzen, verglichen mit den traditionellen Markern, die sich normalerweise auf einen einzelnen Aspekt konzentrieren der Krankheit. Solche prädiktiven Biomarker können auch dem klinischen Management von NAFLD zugute kommen, um das Fortschreiten zu NASH zu begrenzen.

Bestimmte Ziele:

1. Identifizierung der funktionellen Varianten, die Dyslipidämie und die Mutation ihrer ursächlichen Gene bei einer Teilstichprobe von Teilnehmern (30 Patienten) unter Verwendung von Next-Generation-Sequencing (NGS) verursachen.
2. Identifizierung und Verifizierung der 10 signifikantesten Gene (die zuvor in genomweiten Analysen als mit NAFLD/NASH assoziiert identifiziert wurden) in der ägyptischen Bevölkerung: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GC90KR rs7.8 , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 und MTTP rs1800591 unter Verwendung des TaqMan SNP-Genotypisierungsassays
3. Darstellung der möglichen Assoziation genetischer Variationen mit der derzeit verwendeten Behandlung von NAFLD mit und ohne Fibrose (z. B. Vitamin E, Vitamin C, Vitamin D; Metformin für Kinder und Pioglitazon für Erwachsene…)
4. Um das Expressionsniveau von Plasma-miRNAs (die Top 5 von 168-Panel-Genen von Plasma-miRNAs) durch PCR-Array gemäß den untersuchten Gruppen zu identifizieren
5. Bewertung des Potenzials eines veränderten miRNAs-Expressionsprofils im Zusammenhang mit derzeit verwendeten Arzneimitteln zur Behandlung von NAFLD ohne oder mit Fibrose.
6. Zur Identifizierung des Glykosylierungsprofils sowohl von N- als auch von O-Glykoproteinen, die bei ägyptischen Patienten mit NAFLD ohne oder mit NAFLD (Transferrin, Apolipoprotein C III (apoC III), Haptoglobin, Mac2-Bindungsprotein, IgG) in Verbindung gebracht wurden Fibrose
7. Bewertung der Beziehung zwischen dem Glykosylierungsmuster der untersuchten Glykoproteine ​​als Reaktion auf das derzeit verwendete Medikament für die Behandlung mit NAFLD MIT UND OHNE FIBROSE.
8. Zur Identifizierung der Bakterienisolate unter den ägyptischen Populationen, die mit NAFLD-Patienten ohne und mit Fibrose und Kontrollen (von 10 Bakterienisolaten) in Verbindung gebracht werden, unter Verwendung des -Rapid RT-PCR-Tests für die Vorbereitung und Sequenzierung der 16S-rRNA-Gen-Amplikon-Bibliothek
9. Identifizierung der fünf am häufigsten im Speichel nachgewiesenen mikrobiombezogenen Metaboliten durch Vergleich ihrer Konzentrationen für NAFLD ohne und mit Fibrose und Kontrolle mittels Gaschromatographie-Massenspektrometer (GC-MS)-Analyse
10. Um die Assoziation einiger bekannter metagenomischer Funktionen unter Verwendung kommerzieller ELISA-Kits zu bewerten. (Speichelkonzentrationen von Lactoferrin, Lipopolysaccharid und Immunglobulin A zum Nachweis von NAFLD ohne und mit Fibrose.
11. Um zu bestimmen, ob Kombinationen der nachgewiesenen Speichelmetaboliten als Biomarker-Signatur zum Nachweis von NAFLD ohne und mit Fibrose verwendet werden könnten.
12. Identifizierung der Interaktion und des Einflusses des epidemiologischen, diätetischen und Lebensstils auf die untersuchten Multi-Omics-Biomarker und auf das klinische Erscheinungsbild von NAFLD ohne und mit Fibrose.

Forschungsmethodik und -instrumente

Diese Studie ist eine explorative Querschnittsstudie, die über einen Zeitraum von 24 Monaten durchgeführt wurde:

1. Fragebogen zur Ausgangsbewertung:

   1.1 Erhebung der soziodemografischen Merkmale, ausführliche Anamneseerhebung und sonstige bekannte Risikofaktoren (Mundhygiene….), Erstellung des Familienstammbaums bis zu drei Generationen zur Diagnose des Risikos genetischer und familiärer Ursachen für NAFLD und NASH

2. In dieser Studie werden Multi-Omics-Biomarker in Blut und Lebend untersucht. Der Ansatz basiert auf dem Nachweis neuer molekularer Pathogenesen und neuer Gene zur Entdeckung ägyptischer Biomarker der untersuchten Multiomics-Marker.

   2.1 Blutproben: Genomik

   2.1.1.1 Nachweis von Genen, die an Dyslipidämie beteiligt sind: Identifizierung von funktionellen Varianten, die für Dyslipidämie verantwortlich sind, unter Verwendung von Next-Generation-Sequencing (NGS)-Panels von Dyslipidämie-Hauptgenen; (LDLR), (APOB), (PCSK9) und (LDLRAP). Diese Technik kann uns dabei helfen, neue Varianten im Zusammenhang mit Dyslipidämie und solche zu identifizieren, die häufig mit der ägyptischen Bevölkerung verwandt sind. Dies wird auf 30 Teilnehmer angewendet, bei denen nur eine Dyslipidämie diagnostiziert wurde.

   2.1.1.2 Nachweis von Genpolymorphismus für NAFLD und NASH durch "TaqMan SNP Genotyping Assay" für das gesamte Genom, das zuvor in genomweiten Analysen identifiziert wurde, um mit NAFLD/NASH in Verbindung gebracht zu werden (in der ägyptischen Bevölkerung zu verifizieren) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424 , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 und MTTP rs1800591: von allen Teilnehmern

   • DNA wird aus dem peripheren Blut unter Verwendung eines von Qiagen, USA, gelieferten DNA-Extraktionskits unter Verwendung von Nanodropper 2000 (ThermoScientific) extrahiert.
   • Die SNP-Genotypisierung wird unter Verwendung des Echtzeit-PCR-Systems von Roche (Light Cycler 480) mit dem TaqMan-Alleldiskriminierungsassay (Applied Biosystems, USA) durchgeführt.

   2.1.2 Epigenomik Expressionsprofilierung von Plasma-microRNAs

   • Expressionsanalyse der Top-5-miRNAs: Die Top-5 der veränderten miRNAs werden ausgewählt, um bei allen Patienten und Kontrollen durch Echtzeit-PCR unter Verwendung des Quecksilber-LNA-SYBR-Green-PCR-Kits (Qiagen) analysiert zu werden. Die fache Änderung der miRNA wird mit der 2-∆Ct-Methode berechnet.

   2.1.3 Glykoproteomik: Identifizierung des Glykosylierungsmusters Transferrin, Apolipoprotein C III (apoC III), Haptoglobin, Mac2-Bindungsprotein, IgG (Santa Cruz, USA). T

   2.2 Speichelproben: 2.2.1 Speichel-Metabolomik 2.2.2 Metaboliten-Identifizierung mittels Gaschromatographie-Massenspektrometer (GC-MS)-Analyse: Bewertung der Konzentration der fünf wichtigsten identifizierten mikrobiellen Metaboliten (die in mindestens 85 % der Proben) als Metabolomik-Biomarker bei allen Teilnehmern mittels GC-MS-Analyse untersucht.

   2.2.3 Vorhersageanalyse einiger bekannter metagenomischer Funktionen. Bei allen Teilnehmern werden die Speichelkonzentrationen von Lactoferrin, Lipopolysaccharid (LPS) und Immunglobulin A (IgA) bestimmt.

3. Verhaltensänderung durch individuelle Beratung