NAFLD/잠재적 NASH의 Omics 기반 예측자

이집트 HCV 감염 환자를 치료하기 위한 내국민 치료 프로그램은 이집트 인구 사이에서 HCV가 없고 건강한 간을 향한 빛나는 빛이었습니다. 그러나 사망률과 이환율이 모두 증가하고 전 세계적으로 25-35%의 추정 유병률과 함께 빠르게 진화하는 또 다른 간 질환이 등장했습니다. 비알코올성 지방간 질환(NAFLD). NAFLD의 가장 높은 비율은 중동(32%)에서 보고되었습니다. 일반 인구에서 NAFLD의 유병률은 나이가 들면서 증가합니다. 어린이는 3%, 청소년은 5%, 20~40세는 18%, 40~50세는 39%, 70세 이상은 40% 이상입니다.

NAFLD는 단순 지방증에서 비알코올성 지방간염(NASH) 및 간 섬유증으로 스펙트럼이 진행되어 잠재적으로 간경화, 간세포 암종 및 간부전으로 이어지는 대사 장애입니다. 따라서 NASH는 심각한 형태의 NAFLD로 간주됩니다. NAFLD와 비만, 제2형 당뇨병, 좌식 생활 방식, 이상지질혈증, 건강에 해로운 식습관 등 세계적인 유행병과의 연관성을 고려할 때 NAFLD의 유병률은 증가할 것으로 예상됩니다. 따라서 NAFLD는 세계 의료 시스템에 대한 주요 임상 및 경제적 부담입니다.

간 생검이 NASH와 관련된 섬유증 평가를 위한 참조 표준이지만 침습적 절차의 고유한 한계와 반복 샘플링의 필요성으로 인해 간 생검의 대안으로 여러 비침습적 검사(NIT)가 개발되었습니다. . 현재 NIT는 NAFLD 환자의 진행성 섬유증 진단에 사용되었습니다(5). 이러한 NIT는 대부분 생물학적(혈청 바이오마커 알고리즘) 또는 물리적(조직 강성의 영상 평가) 평가를 포함합니다. 그러나 현재 사용 가능한 NIT에는 가변성, 부적절한 정확도 및 오류 위험 요소와 같은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 현재의 NIT는 만성 C형 간염에서 유의한 섬유증을 진단하는 데 뿐만 아니라 NAFLD/NASH 환자의 진행성 섬유증 진단에도 사용되었습니다.

자원이 부족한 국가에서는 NAFLD의 높은 유병률과 초기 단계가 식이 요법 및 생활 방식 수정으로 되돌릴 수 있음에도 불구하고 NIT의 가용성은 제한적일 수 있으며, 특히 더 비싼 영상 기반 검사의 경우 더욱 그렇습니다. 따라서 혈액 기반 바이오마커는 매력적이지만 현재까지 사용할 수 있는 바이오마커는 진단 정확도가 보통 수준에 불과합니다. 더욱이 NAFLD 사례의 소수만이 진단되고 올바르게 치료되는데, 이는 비침습적이고 신뢰할 수 있고 검증된 조기 진단 방법의 부족으로 인해 초기 단계를 발견하는 데 방해가 되기 때문입니다. 또한 NASH 관리에 사용할 수 있는 옵션이 거의 없으며 NAFLD에 대해 현재 FDA 승인 치료법이 없습니다.

현재까지 NAFLD의 병인은 완전히 밝혀지지 않았습니다. NAFLD는 식이, 유전적 감수성 및 장내 미생물 사이의 복잡한 상호작용에 관여하는 것으로 생각됩니다(6). 동시에, NAFLD에서 장내 미생물과 미생물 대사 산물의 역할이 더 많은 관심을 끌었습니다. 장내 미생물군은 장-간 축을 기반으로 NAFLD의 발달과 진행을 조절합니다. 따라서 NASH 환자에 대한 효과적인 치료법을 개발하기 위해서는 병원성 경로에 기반한 향후 표적 치료 전략이 필요합니다.

대체로 생물학적 분자를 높은 처리량으로 측정하는 것과 관련된 과학 분야를 "omics"라고 합니다. 그러나 유전체학, 단백질체학 및 대사체학과 같은 오믹스 기술의 지속적인 기술 발전은 유용한 비침습적 바이오마커의 발견과 NAFLD 및 NASH 진단, 예후 및 약물 반응에 대한 병태생리학적 이해의 증가에 대한 큰 가능성을 가지고 있습니다. 대다수는 하나의 omics 기술을 적용했습니다. 인간 유전학의 발전은 NASH 발병에 대한 유전적 위험 요인과 환경적 위험 요인 사이의 상호 작용에 대한 향상된 이해를 바탕으로 NASH 치료제에 대한 긴급한 요구를 해결할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. MicroRNA(miRNA)는 지방대사에 관여하는 유전자와 NAFLD의 발병기전과 관련된 전염증 인자를 표적으로 하여 NAFLD와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되었다. 또한 대부분의 혈청 당단백질이 간에서 합성되기 때문에 많은 당단백질이 간 질환의 진단과 관련이 있습니다. 불행하게도, 몇몇 선구적인 연구는 NAFLD/NASH를 조사하기 위해 다중 오믹스 기술을 성공적으로 적용했으며, 그 중 어느 것도 이집트 인구 사이에서 수행되지 않았습니다.

연구자들은 일반적으로 단일 측면에 초점을 맞추는 기존 마커와 비교하여 NAFLD 진단의 예측력을 개선하고 NASH로의 진행을 제한하기 위해 이집트 스코어링 시스템으로 사용할 다중 오믹스 복합 예측 바이오마커 패널을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 질병의. 이러한 예측 바이오마커는 또한 NASH로의 진행을 제한하기 위해 NAFLD의 임상 관리에 도움이 될 수 있습니다.

구체적인 목표:

1. 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 참가자 하위 샘플(환자 30명)에서 이상지질혈증을 유발하는 기능적 변이와 그 원인 유전자 돌연변이를 확인합니다.
2. 이집트 인구 중에서 가장 중요한 10개 유전자(이전에 게놈 전체 분석에서 NAFLD/NASH와 관련이 있는 것으로 확인됨)를 식별하고 확인하기 위해: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, 0GC09 4rs , TaqMan SNP 유전형 분석 어세이를 사용하는 PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 및 MTTP rs1800591
3. 섬유증이 있거나 없는 NAFLD에 현재 사용되는 치료법(예: 비타민 E, 비타민 c, 비타민 D, 어린이의 경우 메트포르민, 성인의 경우 피오글리타존…)과 유전적 변이의 가능한 연관성을 설명합니다.
4. 연구 그룹에 따라 PCR 어레이를 통해 혈장 miRNA(혈장 miRNA의 168개 패널 유전자 중 상위 5개 유전자)의 발현 수준을 확인하기 위해
5. 섬유증이 있거나 없는 NAFLD의 치료를 위해 현재 사용되는 약물과 관련된 변경된 miRNA 발현 프로파일의 가능성을 평가하기 위함.
6. NAFLD/NASH(트랜스페린, 아포지단백 C III(apoC III), 합토글로빈, Mac2 결합 단백질, IgG) -)와 관련이 있는 것으로 입증된 N- 및 O-당단백질의 글리코실화 프로필을 확인하기 위해 NAFLD가 있거나 없는 이집트 환자에서 섬유증
7. 섬유증이 있는 NAFLD 및 섬유소가 없는 NAFLD 치료에 현재 사용되는 약물에 대한 연구된 당단백질의 당화 패턴 사이의 관계를 평가합니다.
8. 16S rRNA 유전자 앰플리콘 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위한 -Rapid RT-PCR 테스트를 사용하여 섬유증이 있거나 없는 NAFLD 환자 및 대조군(10개의 박테리아 분리주 중)과 연결된 이집트 인구 중 박테리아 분리주를 식별하기 위해
9. Gas Chromatography-Mass Spectrometer(GC-MS) 분석을 사용하여 섬유증이 있거나 없는 NAFLD 및 대조군의 농도를 비교하여 상위 5개의 타액 검출 미생물군유전체 관련 대사산물을 식별합니다.
10. 상용 ELISA 키트를 사용하여 일부 알려진 메타 게놈 기능의 연관성을 평가합니다. (섬유증 유무에 관계없이 NAFLD를 검출하기 위한 락토페린, 지질다당류 및 면역글로불린 A의 타액 농도.
11. 검출된 타액 대사산물의 조합이 섬유증이 있거나 없는 NAFLD를 검출하기 위한 바이오마커 시그너처로 사용될 수 있는지 여부를 결정합니다.
12. 연구된 다중 오믹스 바이오마커 및 섬유증이 있거나 없는 NAFLD의 임상적 표현에 대한 역학, 식이, 생활 방식의 상호 작용 및 영향을 확인합니다.

연구 방법론 및 도구

이 연구는 24개월 도구에 따라 수행된 단면 탐색 연구입니다.

1. 기본 평가 질문지:

   1.1 사회인구학적 특성 평가, 자세한 병력청취, 기타 알려진 위험인자(구강위생….), NAFLD 및 NASH에 대한 유전적 및 가족적 원인의 위험을 진단하기 위해 최대 3세대까지의 가족 혈통 구성 1.2 식단 품질 지수 평가 설문지, 음료 섭취를 사용한 인체 측정을 ​​통한 영양 및 식이 행동 평가

2. 이 연구에서는 혈액 및 살아있는 다중 오믹스 바이오마커를 조사할 것입니다. 이 접근 방식은 연구된 다중 오믹스 마커의 이집트 관련 바이오마커를 발견하기 위한 새로운 분자 병원체 및 새로운 유전자를 감지하는 데 기반을 두고 있습니다.

   2.1 혈액 샘플: 유전체학

   2.1.1.1 이상지질혈증 관련 유전자 검출: 이상지질혈증 주요 유전자의 NGS(next-generation sequencing) 패널을 이용하여 이상지질혈증의 원인이 되는 기능적 변이체 식별; (LDLR), (APOB), (PCSK9) 및 (LDLRAP). 이 기술은 새로운 이상지질혈증 관련 변종과 일반적으로 이집트 인구와 관련된 변종을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 이상지질혈증 진단을 받은 참가자 30명에게만 적용됩니다.

   2.1.1.2 NAFLD/NASH(이집트 인구 중에서 확인 예정)와 관련이 있는 것으로 게놈 전체 분석에서 이전에 확인된 전체 게놈에 대한 "TaqMan SNP 유전형 분석"에 의한 NAFLD 및 NASH의 유전자 다형성 검출 , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 및 MTTP rs1800591: 모든 참가자로부터

   • Nanodropper 2000(ThermoScientific)을 사용하여 미국 Qiagen에서 공급하는 DNA 추출 키트를 사용하여 말초 혈액에서 DNA를 추출할 것입니다.
   • SNP 유전자형 분석은 Roche 실시간 PCR 시스템(light cycler 480)과 TaqMan 대립 유전자 변별 분석(Applied Biosystems, USA)을 사용하여 수행됩니다.

   2.1.2 혈장 microRNA의 Epi-genomics 발현 프로파일링

   • 상위 5개 miRNA의 발현 분석: 수은 LNA SYBR Green PCR 키트(Qiagen)를 사용하여 실시간 PCR로 모든 환자 및 대조군에서 분석할 상위 5개의 변경된 miRNA를 선택합니다. miRNA의 배수 변화는 2-∆Ct 방법을 사용하여 계산됩니다.

   2.1.3 Glycoproteomics: 글리코실화 패턴 트랜스페린, 아포지단백 C III(apoC III), 합토글로빈, Mac2 결합 단백질, IgG(Santa Cruz, USA) 확인. 티

   2.2 타액 샘플: 2.2.1 타액 대사체학 2.2.2 가스 크로마토그래피-질량 분석기(GC-MS) 분석을 사용한 대사체 식별: 확인된 상위 5개 미생물 관련 대사체의 농도 평가(최소한 85%에서 발견됨) GC-MS 분석을 사용하여 모든 참가자 중 대사체학 바이오마커로 조사할 것입니다.

   2.2.3 일부 알려진 메타 게놈 기능의 예측 분석. 락토페린, 리포폴리사카라이드(LPS) 및 면역글로불린 A(IgA)의 타액 농도는 모든 참가자에 대해 결정됩니다.

3. 개인상담을 통한 행동교정