Predittori basati su Omics di NAFLD/Potential NASH

Il programma di trattamento nazionale inteso a fornire una cura per i pazienti egiziani con infezione da HCV è stato la luce scintillante verso un fegato sano e libero da HCV tra la popolazione egiziana. Tuttavia, sta emergendo un'altra malattia epatica in rapida evoluzione con un aumento sia della mortalità che della morbilità e una prevalenza stimata del 25-35% in tutto il mondo; steatosi epatica non alcolica (NAFLD). Il tasso più alto di NAFLD è riportato dal Medio Oriente (32%). La prevalenza della NAFLD nella popolazione generale aumenta con l'età; dal 3% nei bambini, al 5% negli adolescenti, al 18% tra i 20 ei 40 anni, al 39% in quelli di età compresa tra 40 e 50 anni, e ad oltre il 40% in quelli con più di 70 anni.

La NAFLD è una malattia metabolica, il cui spettro progredisce dalla semplice steatosi alla steatoepatite non alcolica (NASH) e alla fibrosi epatica, portando potenzialmente a cirrosi, carcinoma epatocellulare e insufficienza epatica. Di conseguenza, la NASH è considerata una forma grave di NAFLD. Data l'associazione tra NAFLD e le crescenti epidemie globali di obesità, diabete di tipo 2, stili di vita sedentari, dislipidemia e abitudini alimentari malsane, si prevede che la prevalenza di NAFLD aumenterà. Pertanto, la NAFLD rappresenta un onere clinico ed economico importante per i sistemi sanitari mondiali.

Sebbene la biopsia epatica sia lo standard di riferimento per la valutazione della fibrosi associata alla NASH, i limiti intrinseci di una procedura invasiva e la necessità di ripetere il campionamento hanno portato allo sviluppo di numerosi test non invasivi (NIT) come alternative alla biopsia epatica . Gli attuali NIT sono stati utilizzati per la diagnosi di fibrosi avanzata in pazienti con NAFLD (5). Tali NIT includono principalmente valutazioni biologiche (algoritmi di biomarcatori sierici) o fisiche (valutazione mediante imaging della rigidità tissutale). Tuttavia, i NIT attualmente disponibili hanno diverse limitazioni, come variabilità, accuratezza inadeguata e fattori di rischio di errore. Le attuali NIT sono state utilizzate non solo per diagnosticare una fibrosi significativa nell'epatite C cronica, ma anche per la diagnosi di fibrosi avanzata in pazienti con NAFLD/NASH.

Nei paesi con poche risorse, nonostante l'elevata prevalenza di NAFLD e il fatto che i suoi primi stadi siano reversibili con modifiche alla dieta e allo stile di vita, è probabile che la disponibilità di NIT sia limitata, in particolare i più costosi test basati sull'imaging. I biomarcatori a base di sangue sono quindi attraenti, ma quelli disponibili fino ad oggi hanno solo una moderata accuratezza diagnostica. Inoltre, solo una minoranza dei casi di NAFLD viene diagnosticata e trattata correttamente poiché il rilevamento delle fasi iniziali è ostacolato dalla mancanza di metodi non invasivi, affidabili e convalidati di diagnosi precoce. Inoltre, ci sono poche opzioni disponibili per la gestione della NASH e nessuna terapia attualmente approvata dalla FDA per la NAFLD.

Ad oggi, la patogenesi della NAFLD non è completamente chiarita. Si ritiene che la NAFLD sia coinvolta in complesse interazioni tra dieta, suscettibilità genetica e microbiota intestinale (6). Allo stesso tempo, il ruolo del microbiota intestinale e dei metaboliti microbici nella NAFLD ha attirato maggiore attenzione. Il microbiota intestinale regola lo sviluppo e la progressione della NAFLD sulla base dell'asse intestino-fegato. Di conseguenza, sono necessarie future strategie terapeutiche mirate basate sui percorsi patogenetici per sviluppare un trattamento efficace per i pazienti con NASH.

In generale, i campi scientifici associati alla misurazione delle molecole biologiche in modo ad alto rendimento sono chiamati "omici". Tuttavia, i progressi tecnologici in corso nelle tecnologie omiche come la genomica, la proteomica e la metabolomica sono molto promettenti per la scoperta di utili biomarcatori non invasivi e una maggiore comprensione fisiopatologica della diagnosi, della prognosi e della risposta ai farmaci di NAFLD e NASH. La maggior parte ha applicato una tecnica omica. I progressi nella genetica umana presentano nuove opportunità per affrontare l'urgente necessità di terapie NASH, basate su una migliore comprensione dell'interazione tra i fattori di rischio genetici e ambientali per lo sviluppo della NASH. È stato riportato che i microRNA (i miRNA sono strettamente correlati alla NAFLD prendendo di mira i geni coinvolti nel metabolismo lipidico e i fattori pro-infiammatori che sono correlati alla patogenesi della NAFLD. Inoltre, molte glicoproteine ​​sono state collegate alla diagnosi di disturbi epatici dato che la maggior parte delle glicoproteine ​​sieriche è sintetizzata nel fegato. Sfortunatamente, alcuni studi pionieristici hanno applicato con successo tecnologie multi-omiche per studiare NAFLD/NASH, nessuno dei quali è stato fatto tra la popolazione egiziana.

I ricercatori miravano a sviluppare un pannello di biomarcatori predittivi compositi multi-omici da utilizzare come sistema di punteggio egiziano per migliorare il potere predittivo della diagnosi di NAFLD e limitare la sua progressione a NASH, rispetto ai marcatori tradizionali che di solito si concentrano su un singolo aspetto della malattia. Tali biomarcatori predittivi possono anche giovare alla gestione clinica della NAFLD per limitare la sua progressione verso la NASH.

Obiettivi specifici:

1. Identificare le varianti funzionali che causano la dislipidemia e la sua mutazione genica causale su un sottocampione di partecipanti (30 pazienti) utilizzando il sequenziamento di nuova generazione (NGS).
2. Identificare e verificare i 10 geni più significativi (precedentemente identificati per essere associati a NAFLD/NASH nelle analisi genome-wide) nella popolazione egiziana: PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424, COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs121379KR04rs , PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 e MTTP rs1800591 utilizzando TaqMan SNP Genotyping Assay
3. Delineare la possibile associazione delle variazioni genetiche con il trattamento attualmente utilizzato per la NAFLD con e senza fibrosi (ad es. vitamina E, vitamina c, vitamina D; metformina per i bambini e pioglitazone per gli adulti...)
4. Identificare il livello di espressione dei miRNA plasmatici (i primi 5 geni del pannello 168 di miRNA plasmatici) mediante array PCR secondo i gruppi studiati
5. Valutare il potenziale del profilo di espressione di miRNA alterato associato al farmaco attualmente utilizzato per il trattamento della NAFLD senza o con fibrosi.
6. Per identificare il profilo di glicosilazione di entrambe le N- e O-glicoproteine ​​risultate essere collegate con NAFLD/NASH (transferrina, apolipoproteina C III (apoC III), aptoglobina, proteina legante Mac2, IgG) -) tra i pazienti egiziani con NAFLD senza o con fibrosi
7. Valutare la relazione tra il pattern di glicosilazione delle glicoproteine ​​studiate in risposta al farmaco attualmente utilizzato per il trattamento della NAFLD CON E SENZA FIBROSI.
8. Identificare gli isolati batterici tra le popolazioni egiziane che sono collegati a pazienti NAFLD senza e con fibrosi e controlli (su 10 isolati batterici) utilizzando il test RT-PCR rapido per la preparazione e il sequenziamento della libreria di ampliconi del gene 16S rRNA
9. Identificare i primi cinque metaboliti salivari rilevati correlati al microbioma confrontando le loro concentrazioni per NAFLD senza e con fibrosi e controllo utilizzando l'analisi con gascromatografia-spettrometro di massa (GC-MS)
10. Valutare l'associazione di alcune funzioni metagenomiche note utilizzando i kit ELISA commerciali. (concentrazioni salivari di lattoferrina, lipopolisaccaride e immunoglobulina A per la rilevazione della NAFLD senza e con fibrosi.
11. Per determinare se le combinazioni dei metaboliti salivari rilevati potrebbero essere utilizzate come firma biomarcatore per rilevare NAFLD senza e con fibrosi.
12. Identificare l'interazione e l'influenza dello stile di vita epidemiologico, alimentare, sui biomarcatori multi-omici studiati e sulla presentazione clinica della NAFLD senza e con fibrosi.

Metodologia e strumenti della ricerca

Questo studio è uno studio esplorativo trasversale condotto lungo 24 mesi di strumenti:

1. Questionario di valutazione di base:

   1.1 Valutazione delle caratteristiche sociodemografiche, anamnesi dettagliata e altri fattori di rischio noti (igiene orale...), costruzione del pedigree familiare fino a tre generazioni per diagnosticare il rischio di cause genetiche e familiari per NAFLD e NASH 1.2 Valutazione comportamentale nutrizionale e alimentare con misurazioni antropometriche mediante questionario di valutazione dell'indice di qualità della dieta, assunzione di bevande

2. In questo studio saranno studiati biomarcatori multi-omici nel sangue e vivi. L'approccio si basa sulla rilevazione di nuove patogenesi molecolari e di nuovi geni per la scoperta di biomarcatori egiziani dei marcatori multi-omici studiati.

   2.1 Campioni di sangue: Genomica

   2.1.1.1 Rilevazione di geni coinvolti nella dislipidemia: identificazione di varianti funzionali responsabili della dislipidemia mediante pannelli di sequenziamento di nuova generazione (NGS) dei principali geni della dislipidemia; (LDLR), (APOB), (PCSK9) e (LDLRAP). Questa tecnica può aiutarci a identificare nuove varianti correlate alla dislipidemia e quelle correlate comunemente alla popolazione egiziana. Questo verrà applicato a 30 partecipanti con diagnosi di sola dislipidemia.

   2.1.1.2 Rilevamento del polimorfismo genico per NAFLD e NASH mediante "TaqMan SNP Genotyping Assay" per l'intero genoma precedentemente identificato in analisi genome-wide da collegare a NAFLD/NASH (da verificare tra la popolazione egiziana) PNPLA3 rs738409, PNPLA3 rs6006460, FDFT1 rs2645424 , COL13A1 rs1227756, NCAN rs2228603, LYPLAL1 rs12137855, GCKR rs780094, PPP1R3B rs4240624, PPAR rs1800234 e MTTP rs1800591: da tutti i partecipanti

   • Il DNA verrà estratto dal sangue periferico utilizzando un kit di estrazione del DNA fornito da Qiagen, negli Stati Uniti, utilizzando Nanodropper 2000 (ThermoScientific).
   • La genotipizzazione degli SNP sarà eseguita utilizzando il sistema PCR in tempo reale Roche (light cycler 480) con TaqMan allelic discrimination assay (Applied Biosystems, USA).

   2.1.2 Epi-genomica Profili di espressione di microRNA plasmatici

   • Analisi dell'espressione dei primi 5 miRNA: i primi 5 miRNA alterati saranno selezionati per essere analizzati in tutti i pazienti e nei controlli mediante PCR in tempo reale utilizzando il kit mercury LNA SYBR Green PCR (Qiagen). Il cambiamento di piega del miRNA sarà calcolato utilizzando il metodo 2-∆Ct.

   2.1.3 Glicoproteomica: identificazione del pattern di glicosilazione transferrina, apolipoproteina C III (apoC III), aptoglobina, proteina legante Mac2, IgG (Santa Cruz, USA). T

   2.2 Campioni di saliva: 2.2.1 Metabolomica salivare 2.2.2 Identificazione dei metaboliti mediante gascromatografia-spettrometro di massa (GC-MS) Analisi: valutazione della concentrazione dei primi cinque metaboliti microbici identificati (che si trovano in almeno l'85% dei campioni) come biomarcatori metabolomici tra tutti i partecipanti saranno studiati utilizzando l'analisi GC-MS.

   2.2.3 Analisi predittiva di alcune note funzioni metagenomiche. Le concentrazioni salivari di lattoferrina, lipopolisaccaride (LPS) e immunoglobulina A (IgA) saranno determinate per tutti i partecipanti.

3. Modifica comportamentale attraverso la consulenza individuale