硝酸盐 INFORMER 水研究

学习规划

将使用交叉研究设计，干预之间有 1 周的清除期。 干预前一天和干预当天的参与者饮食将标准化（访问 1 的食物选择将与访问 2 匹配）如下：

研究访问前一天：

• 早餐：白面包吐司加鸡蛋、奶酪、花生酱或果酱。
• 将提供午餐，包括南瓜汤和白面包
• 晚餐：低硝酸盐素食餐
• 将提供所有水
• 参与者将被要求避免饮用任何咖啡或含咖啡因的饮料 17 和任何酒精饮料 18 并在研究访问前 24 小时进行任何锻炼。

研究访问当天：

• 参加者将禁食到达研究单位
• 早餐将包括白面包吐司配奶酪、花生酱或果酱以及第一次水干预
• 午餐将包括南瓜汤和白面包以及第二次水干预
• 参与者将获得标准化晚餐：低硝酸盐素食餐
• 将提供所有水
• 参与者将被要求避免饮用任何咖啡或含咖啡因的饮料 17 和任何酒精饮料 18 并在研究访问前 24 小时进行任何锻炼。

干预措施

• 添加硝酸盐的水：在 500 mL 水瓶 (200 mg/L) 中提供 137 mg 硝酸钠或 164 mg 硝酸钾（100 mg 硝酸盐）两次，一次在早餐时提供，一次在午餐时提供。 这相当于总共 200 毫克硝酸盐。

在澳大利亚，2011 年发布的指南建议，低于 50 mg/L 的水平可以安全饮用，50 - 100 mg/L 的水平对于包括孕妇在内的所有成年人都是安全的，但不包括 3 个月以下的婴儿，饮用不推荐硝酸盐浓度大于 100 mg/L 的水。

• 未添加硝酸盐的水：在 500 毫升水瓶中提供 137 毫克氯化钠或 164 毫克氯化钾，分两次提供，一次在早餐时，一次在午餐时。

序列生成。 干预分配的顺序将使用计算机生成的随机数通过块随机化生成。 将使用 2 和 4 的随机块大小。

隐藏机制。 每个研究参与者的 50 个随机生成的干预序列将由不参与执行干预、数据收集或数据分析的研究调查员打印在单独的纸上并密封在不透明信封中，编号为 1-50 .

执行。 一旦参与者被认为符合条件并参加了研究，研究协调员将联系负责随机化和干预分配的研究调查员，以获得下一个可用的信封和随机生成的干预序列。

致盲。 鉴于干预措施的性质，参与者和负责提供干预措施的研究人员将在整个试验过程中揭盲。 然而，所有进行实验室分析和数据分析的研究人员都将不知道参与者接受的干预措施，直到数据分析完成。

参与者时间表。 在第一次门诊就诊之前，每位参与者将完成食物频率问卷 (FFQ) 以评估背景习惯性饮食。

在每次门诊就诊时（图 1），将收集基线尿液和粪便样本以测量 N-亚硝胺。 在干预之前，参与者将被指示将膀胱排空到基线尿液收集容器中。 第一次干预后，将收集随后 24 小时内的所有尿液，用于测量 N-亚硝胺、硝酸盐和亚硝酸盐。 将收集粪便用于测量 N-亚硝胺、硝酸盐和亚硝酸盐。

评估

尿液和粪便收集。 尿液样本将在基线收集，从干预开始直至干预后 24 小时。 对于基线样本，将向参与者提供一个经过消毒的容器和说明，以丢弃当天的第一个尿液样本，然后收集所有尿液，直到将其带入诊所进行干预。 将指示参与者在醒来时喝 250 毫升水。 对于 24 小时尿液样本，将向参与者提供经过消毒的容器和收集所有尿液的说明，直至干预后 24 小时。 尿液等分试样将冷冻在 -80°C 直至分析。 将在基线和第一次干预后的 24 小时内收集粪便样本。 将向参与者提供说明和粪便样本收集包（收集袋、扎带、大拉链袋、冷冻冰块和指定的运输冷藏袋）。 收集的粪便样本将被称重并冷冻在 -80°C 直至分析。

N-亚硝胺。 干预措施、尿液和粪便样本中的亚硝胺将通过气相色谱质谱法 (GCMS) 进行测量。 挥发性亚硝胺将用二氯甲烷萃取，并通过气相色谱很好地分离。 将通过保留时间和五种常见亚硝胺中每一种的独特分子离子进行鉴定。 将使用氘标记的内标 N-亚硝基二甲胺-D6 进行定量； N-亚硝基二乙胺D10； N-亚硝基吗啉 D8 (Cambridge Isotopes) 和 N-nitrosopiperidine D10 (Toronto Research Chemicals)。 最常检测到的亚硝胺是 NDMA 和 N-亚硝基哌啶 (NPIP)。 将进行对照实验，其中将水储存在与用于样品收集和储存的容器相同的容器中，以测试挥发性亚硝胺的任何浸出。

样本量和功效

样本量基于交叉设计和 N-亚硝胺的主要结果，特别是尿液中的 N-亚硝基二甲胺 (NDMA)。 在 α=0.05、每个受试者（基线和后期）2 个测量值和测量值之间 ρ=0.6 的相关性时，25 名参与者将提供 80% 的能力来检测 NDMA 浓度增加 0.6 SD。 考虑到 10% 的退出率，我们计划招募 25 名参与者参与研究。 将对参与者进行滚动招募，直到达到样本量。

统计方法

将使用 IBM SPSS Statistics for Windows，版本 25 (IBM) 和 STATA/IC 17.0 (StataCorp LLC) 进行统计分析。 正态分布连续变量的描述性统计将表示为均值（±标准差，SD），非正态分布连续变量表示为中位数（四分位数间距，IQR），分类变量表示为数量（比例，%）。 在分析之前，将评估数据的异常值和正态性。 非正态分布的数据将在必要时进行日志转换。 结果的治疗效果将使用线性混合模型获得，包括基线测量、治疗顺序、周期和时间（作为分类变量）作为固定效果。 我们还将包括一个治疗 X 期相互作用项，以评估可能的治疗期相互作用，并将单独评估带有虚拟变量的结转效应，以表明先前的治疗。 将使用线性混合模型（包括基线测量值、治疗顺序和作为预测因子的时期）获得单次干预后测量结果的治疗效果。 受试者 ID 号将作为随机截取包含在每个模型中。 P<0.05 的总体 2 侧 1 型错误率将用于评估所有假设检验的统计显着性。