Nitrato INFORMER Estudio de agua

Diseño del estudio

Se utilizará un diseño de estudio cruzado con un período de lavado de 1 semana entre intervenciones. La dieta de los participantes para el día anterior y el día de la intervención se estandarizará (las elecciones de alimentos en la visita 1 se igualarán para la visita 2) de la siguiente manera:

Para el día anterior a la visita de estudio:

• Desayuno: tostadas de pan blanco con huevos, queso, mantequilla de maní o mermelada.
• Se proporcionará un almuerzo compuesto por sopa de calabaza y pan blanco.
• Cena: una comida vegetariana baja en nitratos
• Toda el agua será proporcionada.
• Se les pedirá a los participantes que se abstengan de tomar café o bebidas que contengan cafeína 17 y cualquier bebida alcohólica 18 y que hagan ejercicio 24 horas antes de su visita de estudio.

Para el día de la visita de estudio:

• Los participantes llegarán a la unidad de estudio en ayunas
• El desayuno consistirá en tostadas de pan blanco con queso, mantequilla de maní o mermelada junto con la primera intervención de agua.
• El almuerzo consistirá en sopa de calabaza y pan blanco junto con la segunda intervención de agua.
• Los participantes recibirán una cena estandarizada: una comida vegetariana baja en nitratos
• Toda el agua será proporcionada.
• Se les pedirá a los participantes que se abstengan de tomar café o bebidas que contengan cafeína 17 y cualquier bebida alcohólica 18 y que hagan ejercicio 24 horas antes de su visita de estudio.

Intervenciones

• Agua con nitrato agregado: 137 mg de nitrato de sodio o 164 mg de nitrato de potasio (100 mg de nitrato) en una botella de agua de 500 mL (200 mg/L) proporcionada dos veces, una con el desayuno y otra con el almuerzo. Esto es equivalente a 200 mg de nitrato en total.

En Australia, las pautas publicadas en 2011 recomiendan que los niveles de menos de 50 mg/L sean seguros para beber, los niveles de 50 - 100 mg/L son seguros para beber para todos los adultos, incluidas las mujeres embarazadas, pero no para los bebés menores de 3 meses de edad, beber No se recomienda el agua con concentraciones de nitrato superiores a 100 mg/L.

• Agua sin nitrato añadido: 137 mg de cloruro de sodio o 164 mg de cloruro de potasio en una botella de agua de 500 ml proporcionada dos veces, una con el desayuno y otra con el almuerzo.

Generación de secuencias. La secuencia de asignación de la intervención se generará a través de la aleatorización en bloques utilizando números aleatorios generados por computadora. Se utilizarán tamaños de bloques aleatorios de 2 y 4.

Mecanismo de ocultación. Cincuenta secuencias generadas al azar de las intervenciones para cada uno de los participantes del estudio serán impresas en hojas de papel separadas y selladas en sobres opacos, numerados del 1 al 50, por un investigador del estudio que no participe en la realización de la intervención, la recopilación o el análisis de datos. .

Implementación. Una vez que se considera que un participante es elegible y se inscribe en el estudio, el coordinador del estudio se comunicará con el investigador del estudio responsable de la aleatorización y la asignación de la intervención para obtener el próximo sobre disponible y la secuencia de intervención generada aleatoriamente.

Cegador. Dada la naturaleza de las intervenciones, los participantes y los investigadores responsables de administrar las intervenciones no estarán cegados durante todo el ensayo. Sin embargo, todos los investigadores que realicen los análisis de laboratorio y los análisis de datos no conocerán las intervenciones que recibieron los participantes hasta después de que se haya realizado el análisis de datos.

Cronología de los participantes. Antes de la primera visita a la clínica, cada participante completará un cuestionario de frecuencia de alimentos (FFQ) para evaluar la dieta habitual de fondo.

En cada visita a la clínica (Figura 1), se recolectará una muestra de orina y heces de referencia para la medición de N-nitrosaminas. Antes de la intervención, se indicará a los participantes que vacíen la vejiga en un recipiente de recolección de orina de referencia. Después de la primera intervención, se recolectará toda la orina del período de 24 horas subsiguiente para la medición de N-nitrosaminas, nitrato y nitrito. Se recolectarán heces fecales para la medición de N-nitrosaminas, nitrato y nitrito.

Evaluaciones

Recolección de heces y orina. Se recolectará una muestra de orina al inicio y desde la intervención hasta 24 horas después de la intervención. Para la muestra de referencia, a los participantes se les proporcionará un recipiente esterilizado e instrucciones para desechar la primera muestra de orina del día y luego recolectar toda la orina hasta la intervención que se llevará a la clínica. Se indicará a los participantes que beban 250 ml de agua al despertar. Para las muestras de orina de 24 horas, los participantes recibirán recipientes esterilizados e instrucciones para recolectar toda la orina hasta 24 horas después de la intervención. Las alícuotas de orina se congelarán a -80 °C hasta su análisis. Se recolectará una muestra de heces al inicio y durante el período de 24 horas posterior a la primera intervención. Los participantes recibirán instrucciones y un paquete de recolección de muestras de heces (bolsas de recolección, bridas para cables, bolsas grandes con cierre hermético, bloques de hielo congelador y una bolsa térmica designada para el transporte). Las muestras de heces recogidas se pesarán y congelarán a -80 °C hasta su análisis.

N-nitrosaminas. Las nitrosaminas en las intervenciones, las muestras de orina y heces se medirán mediante espectrometría de masas por cromatografía de gases (GCMS). Las nitrosaminas volátiles se extraen con diclorometano y se separan bien por cromatografía de gases. La identificación será por tiempo de retención e iones moleculares únicos para cada una de las cinco nitrosaminas comunes. La cuantificación se realizará utilizando estándares internos marcados con deuterio, N-nirtrosodimetilamina-D6; N-nitrosodietilamina D10; N-nitrosomorfolina D8 (Cambridge Isotopes) y N-nitrosopiperidina D10 (Toronto Research Chemicals). Las nitrosaminas detectadas con mayor frecuencia son NDMA y N-nitrosopiperidina (NPIP). Se llevarán a cabo experimentos de control en los que el agua almacenada en los mismos recipientes que se usaron para la recolección y el almacenamiento de muestras, para detectar cualquier lixiviación de nitrosaminas volátiles.

Tamaño de la muestra y poder

El tamaño de la muestra se basa en un diseño cruzado y el resultado primario de N-nitrosaminas, específicamente N-nitrosodimetilamina (NDMA) en la orina. Con α=0,05, 2 medidas por sujeto (línea de base y posterior) y una correlación de ρ=0,6 entre las medidas, 25 participantes proporcionarán un 80 % de potencia para detectar un aumento de 0,6 DE en la concentración de NDMA. Para permitir una tasa de retiro del 10 %, planeamos reclutar 25 participantes en el estudio. Se realizará un reclutamiento rotativo de participantes hasta alcanzar el tamaño de la muestra.

métodos de estadística

Los análisis estadísticos se realizarán utilizando IBM SPSS Statistics para Windows, versión 25 (IBM) y STATA/IC 17.0 (StataCorp LLC). Los estadísticos descriptivos de las variables continuas con distribución normal se expresarán como media (± desviación estándar, DE), las variables continuas sin distribución normal como mediana (rango intercuartílico, IQR) y las variables categóricas como número (proporción, %). Los datos se evaluarán en busca de valores atípicos y normalidad antes del análisis. Los datos que no se distribuyen normalmente se transformarán de registro si es necesario. Los efectos del tratamiento para los resultados se obtendrán utilizando modelos mixtos lineales que incluyen medidas de referencia, orden de tratamiento, período y tiempo (como variable categórica) como efectos fijos. También incluiremos un término de interacción entre el tratamiento y el período para evaluar las posibles interacciones entre el período y el tratamiento y evaluaremos por separado los efectos de arrastre con variables ficticias para indicar el tratamiento anterior. Los efectos del tratamiento para los resultados con una única medición posterior a la intervención se obtendrán utilizando modelos mixtos lineales que incluyen mediciones de referencia, orden de tratamiento y período como predictores. El número de identificación del sujeto se incluirá como una intersección aleatoria en cada modelo. Se utilizará una tasa de error de tipo 1 bilateral general de P<0,05 para evaluar la significación estadística de todas las pruebas de hipótesis.