Nitrato INFORMER Water Study

Progettazione dello studio

Verrà utilizzato un disegno di studio crossover con un periodo di sospensione di 1 settimana tra gli interventi. La dieta dei partecipanti per il giorno prima e il giorno dell'intervento sarà standardizzata (le scelte alimentari alla visita 1 saranno abbinate alla visita 2) come segue:

Per il giorno prima della visita di studio:

• Colazione: toast di pane bianco con uova, formaggio, burro di arachidi o marmellata.
• Il pranzo sarà fornito con zuppa di zucca e pane bianco
• Cena: un pasto vegetariano a basso contenuto di nitrati
• Tutta l'acqua sarà fornita
• Ai partecipanti verrà chiesto di astenersi dal bere caffè o bevande contenenti caffeina 17 e qualsiasi bevanda alcolica 18 e fare qualsiasi esercizio 24 ore prima della loro visita di studio.

Per il giorno della visita di studio:

• I partecipanti arriveranno all'unità di studio a digiuno
• La colazione comprenderà toast di pane bianco con formaggio, burro di arachidi o marmellata insieme al primo intervento di acqua
• Il pranzo comprenderà zuppa di zucca e pane bianco insieme al secondo intervento idrico
• Ai partecipanti verrà fornita una cena standardizzata: un pasto vegetariano a basso contenuto di nitrati
• Tutta l'acqua sarà fornita
• Ai partecipanti verrà chiesto di astenersi dal bere caffè o bevande contenenti caffeina 17 e qualsiasi bevanda alcolica 18 e fare qualsiasi esercizio 24 ore prima della loro visita di studio.

Interventi

• Acqua addizionata di nitrato: 137 mg di nitrato di sodio o 164 mg di nitrato di potassio (100 mg di nitrato) in una bottiglia d'acqua da 500 ml (200 mg/L) fornita due volte, una a colazione e una a pranzo. Ciò equivale a 200 mg di nitrato in totale.

In Australia, le linee guida pubblicate nel 2011 raccomandano che livelli inferiori a 50 mg/L siano sicuri da bere, livelli di 50 - 100 mg/L siano sicuri da bere per tutti gli adulti comprese le donne incinte ma non per i bambini di età inferiore a 3 mesi, che bevono l'acqua con concentrazioni di nitrati superiori a 100 mg/L non è consigliata.

• Acqua senza nitrati aggiunti: 137 mg di cloruro di sodio o 164 mg di cloruro di potassio in una bottiglia d'acqua da 500 ml fornita due volte, una a colazione e una a pranzo.

Generazione di sequenze. La sequenza di assegnazione dell'intervento sarà generata tramite randomizzazione a blocchi utilizzando numeri casuali generati dal computer. Verranno utilizzate dimensioni di blocco casuali di 2 e 4.

Meccanismo di occultamento. Cinquanta sequenze generate casualmente degli interventi per ciascuno dei partecipanti allo studio saranno stampate su fogli di carta separati e sigillate in buste opache, numerate da 1 a 50, da un ricercatore dello studio non coinvolto nell'esecuzione dell'intervento, della raccolta dei dati o dell'analisi dei dati .

Implementazione. Una volta che un partecipante è ritenuto idoneo e arruolato nello studio, il coordinatore dello studio contatterà lo sperimentatore dello studio responsabile della randomizzazione e dell'assegnazione dell'intervento per ottenere la successiva busta disponibile e la sequenza di intervento generata in modo casuale.

Accecante. Data la natura degli interventi, i partecipanti e gli investigatori responsabili della consegna degli interventi saranno aperti durante tutto il processo. Tuttavia, tutti i ricercatori che eseguono le analisi di laboratorio e le analisi dei dati saranno ciechi agli interventi che i partecipanti hanno ricevuto fino a quando l'analisi dei dati non sarà stata eseguita.

Cronologia dei partecipanti. Prima della prima visita clinica, ogni partecipante compilerà un questionario sulla frequenza alimentare (FFQ) per valutare la dieta abituale di base.

Ad ogni visita clinica (Figura 1), verrà raccolto un campione di urina e feci fecali di base per la misurazione delle N-nitrosammine. Prima dell'intervento, ai partecipanti verrà chiesto di svuotare la vescica nel contenitore per la raccolta delle urine di base. Dopo il primo intervento verrà raccolta tutta l'urina per il successivo periodo di 24 ore per la misurazione di N-nitrosammine, nitrati e nitriti. Verranno raccolte feci fecali per la misurazione di N-nitrosammine, nitrati e nitriti.

Valutazioni

Raccolta di urine e feci fecali. Verrà raccolto un campione di urina al basale e dall'intervento fino a 24 ore dopo l'intervento. Per il campione di base, ai partecipanti verrà fornito un contenitore sterilizzato e le istruzioni per scartare il primo campione di urina del giorno e quindi raccogliere tutte le urine fino all'intervento che verrà portato in clinica. Ai partecipanti verrà chiesto di bere 250 ml di acqua al risveglio. Per i campioni di urina delle 24 ore, ai partecipanti verranno forniti contenitori sterilizzati e istruzioni per raccogliere tutta l'urina fino a 24 ore dopo l'intervento. Le aliquote di urina saranno congelate a -80°C fino all'analisi. Verrà raccolto un campione di feci al basale e per il periodo di 24 ore dopo il primo intervento. Ai partecipanti verranno fornite le istruzioni e un pacchetto per la raccolta dei campioni di feci (sacchetti di raccolta, fascette per cavi, grandi sacchetti con chiusura a zip, blocchi di ghiaccio per congelatore e una borsa termica designata per il trasporto). I campioni di feci raccolti saranno pesati e congelati a -80°C fino all'analisi.

N-nitrosammine. Le nitrosammine negli interventi, i campioni di urina e feci saranno misurati mediante spettrometria di massa gascromatografica (GCMS). Le nitrosammine volatili saranno estratte con diclorometano e saranno ben separate mediante gascromatografia. L'identificazione avverrà in base al tempo di ritenzione e agli ioni molecolari univoci per ciascuna delle cinque nitrosammine comuni. La quantificazione sarà effettuata utilizzando standard interni marcati con deuterio, N-nirtrosodimetilammina-D6; N-nitrosodietilammina D10; N-nitrosomorfolina D8 (Isotopi di Cambridge) e N-nitrosopiperidina D10 (Toronto Research Chemicals). Le nitrosammine più comunemente rilevate sono NDMA e N-nitrosopiperidina (NPIP). Verranno eseguiti esperimenti di controllo in cui l'acqua immagazzinata negli stessi contenitori utilizzati per la raccolta e la conservazione dei campioni verrà testata per l'eventuale lisciviazione di nitrosammine volatili.

Dimensione e potenza del campione

La dimensione del campione si basa su un disegno incrociato e sull'esito primario delle N-nitrosammine, in particolare la N-nitrosodimetilammina (NDMA) nelle urine. A α=0,05, 2 misure per soggetto (basale e post) e una correlazione di ρ=0,6 tra le misure, 25 partecipanti forniranno l'80% di potenza per rilevare un aumento di 0,6 DS nella concentrazione di NDMA. Per consentire un tasso di prelievo del 10%, prevediamo di reclutare 25 partecipanti allo studio. Verrà eseguito un reclutamento a rotazione dei partecipanti fino al raggiungimento della dimensione del campione.

metodi statistici

Le analisi statistiche verranno eseguite utilizzando IBM SPSS Statistics per Windows, versione 25 (IBM) e STATA/IC 17.0 (StataCorp LLC). Le statistiche descrittive delle variabili continue normalmente distribuite saranno espresse come media (± deviazione standard, SD), le variabili continue non normalmente distribuite come mediana (intervallo interquartile, IQR) e le variabili categoriali come numero (proporzione, %). I dati saranno valutati per i valori anomali e la normalità prima dell'analisi. I dati non distribuiti normalmente verranno trasformati in log se necessario. Gli effetti del trattamento per i risultati saranno ottenuti utilizzando modelli misti lineari che includono misurazioni di base, ordine di trattamento, periodo e tempo (come variabile categorica) come effetti fissi. Includeremo anche un termine di interazione del periodo X di trattamento per valutare possibili interazioni trattamento-periodo e valuteremo separatamente gli effetti di trascinamento con variabili fittizie per indicare il trattamento precedente. Gli effetti del trattamento per i risultati con una singola misurazione post-intervento saranno ottenuti utilizzando modelli misti lineari che includono misurazioni di base, ordine di trattamento e periodo come predittori. Il numero ID del soggetto sarà incluso come intercettazione casuale in ogni modello. Verrà utilizzato un tasso di errore di tipo 1 bilaterale complessivo di P <0, 05 per valutare la significatività statistica per tutti i test di ipotesi.