Nitrat INFORMER Vandundersøgelse

Studere design

Et crossover-studiedesign vil blive brugt med en 1-uges udvaskningsperiode mellem interventionerne. Deltagernes kost for dagen før og dagen for interventionen vil blive standardiseret (madvalg på besøg 1 vil blive matchet med besøg 2) som følger:

For dagen før studiebesøget:

• Morgenmad: hvidt brød toast med æg, ost, jordnøddesmør eller marmelade.
• Der vil blive serveret frokost bestående af græskarsuppe og hvidt brød
• Aftensmad: et vegetarisk måltid med lavt nitratindhold
• Alt vand vil blive leveret
• Deltagerne vil blive bedt om at afstå fra at drikke kaffe eller koffein indeholdende drikkevarer 17 og enhver alkoholisk drik 18 og gøre enhver motion 24 timer før deres studiebesøg.

For dagen for studiebesøget:

• Deltagerne ankommer til studieenheden fastende
• Morgenmaden vil omfatte hvidt brød toast med ost, jordnøddesmør eller marmelade sammen med den første vandindsats
• Frokosten vil omfatte græskarsuppe og hvidt brød sammen med den anden vandindsats
• Deltagerne vil blive forsynet med en standardiseret middag: et vegetarisk måltid med lavt nitratindhold
• Alt vand vil blive leveret
• Deltagerne vil blive bedt om at afstå fra at drikke kaffe eller koffein indeholdende drikkevarer 17 og enhver alkoholisk drik 18 og gøre enhver motion 24 timer før deres studiebesøg.

Interventioner

• Vand tilsat nitrat: 137 mg natriumnitrat eller 164 mg kaliumnitrat (100 mg nitrat) i en 500 ml vandflaske (200 mg/L) leveret to gange, en med morgenmad og en med frokost. Dette svarer til 200 mg nitrat i alt.

I Australien anbefaler retningslinjer offentliggjort i 2011, at niveauer på under 50 mg/L er sikre at drikke, niveauer på 50 - 100 mg/L er sikre at drikke for alle voksne, inklusive gravide kvinder, men ikke spædbørn under 3 måneder gamle, drikkevarer vand med nitratkoncentrationer større end 100 mg/L anbefales ikke.

• Vand uden tilsat nitrat: 137 mg natriumchlorid eller 164 mg kaliumchlorid i en 500 ml vandflaske medfølger to gange, en med morgenmad og en med frokost.

Sekvensgenerering. Rækkefølgen af ​​interventionstildeling vil blive genereret via blokrandomisering ved hjælp af computergenererede tilfældige tal. Tilfældige blokstørrelser på 2 og 4 vil blive brugt.

Skjulningsmekanisme. Halvtreds tilfældigt genererede sekvenser af interventionerne for hver af undersøgelsesdeltagerne vil blive trykt på separate stykker papir og forseglet i uigennemsigtige kuverter, nummereret 1-50, af en undersøgelsesforsker, der ikke er involveret i at udføre interventionen, dataindsamlingen eller dataanalysen .

Implementering. Når en deltager anses for at være kvalificeret og tilmeldt undersøgelsen, vil undersøgelseskoordinatoren kontakte undersøgelsesinvestigatoren, der er ansvarlig for randomisering og interventionstildeling for at opnå den næste tilgængelige konvolut og tilfældigt genererede interventionssekvens.

Blænding. I betragtning af arten af ​​interventionerne vil deltagerne og de efterforskere, der er ansvarlige for at levere interventionerne, være afblindede under hele forsøget. Alle forskere, der udfører laboratorieanalyserne og dataanalyserne, vil dog blive blindet over for de interventioner, som deltagerne har modtaget, indtil efter at dataanalysen er udført.

Tidslinje for deltagere. Forud for det første klinikbesøg vil hver deltager udfylde et madfrekvensspørgeskema (FFQ) for at vurdere den almindelige kost.

Ved hvert klinikbesøg (figur 1) vil der blive indsamlet en baseline urin- og fæcesprøve til måling af N-nitrosaminer. Forud for interventionen vil deltagerne blive instrueret i at tømme deres blære i baseline-urinopsamlingsbeholderen. Efter den første intervention vil al urin for den efterfølgende 24-timers periode blive opsamlet til måling af N-nitrosaminer, nitrat og nitrit. En fækal afføring vil blive indsamlet til måling af N-nitrosaminer, nitrat og nitrit.

Vurderinger

Opsamling af urin og fækal afføring. En urinprøve vil blive indsamlet ved baseline og fra intervention op til 24 timer efter intervention. Til basislinjeprøven vil deltagerne blive forsynet med en steriliseret beholder og instruktioner om at kassere dagens første urinprøve og derefter indsamle al urin indtil interventionen, som vil blive bragt ind i klinikken. Deltagerne vil blive instrueret i at drikke 250 ml vand, når de vågner. Til 24-timers urinprøver vil deltagerne blive forsynet med steriliserede beholdere og instruktioner til at indsamle al urin indtil 24 timer efter intervention. Urinalikvoter vil blive frosset ved -80°C indtil analyse. En afføringsprøve vil blive indsamlet ved baseline og i 24 timers perioden efter den første intervention. Deltagerne vil blive forsynet med instruktioner og en afføringsprøveindsamlingspakke (indsamlingsposer, kabelbindere, store lynlåsposer, fryseisblokke og en udpeget køletaske til transport). Opsamlede afføringsprøver vejes og fryses ved -80°C indtil analyse.

N-nitrosaminer. Nitrosaminer i indgrebene, urin og afføringsprøver vil blive målt ved gaskromatografi massespektrometri (GCMS). Flygtige nitrosaminer vil blive ekstraheret med dichlormethan og er godt adskilt ved gaskromatografi. Identifikation vil ske ved retentionstid og unikke molekylære ioner for hver af fem almindelige nitrosaminer. Kvantificering vil blive foretaget ved at bruge deuterium-mærkede interne standarder, N-nirtrosodimethylamin-D6; N-nitrosodiethylamin D10; N-nitrosomorpholin D8 (Cambridge Isotoper) og N-nitrosopiperidin D10 (Toronto Research Chemicals). De mest almindeligt påviste nitrosaminer er NDMA og N-Nitrosopiperidin (NPIP). Kontrolforsøg, hvor vand opbevaret i de samme beholdere som dem, der bruges til prøveopsamling og opbevaring, vil blive udført for at teste for eventuel udvaskning af flygtige nitrosaminer.

Prøvestørrelse og kraft

Prøvestørrelsen er baseret på et crossover-design og det primære resultat af N-nitrosaminer, specifikt N-Nitrosodimethylamin (NDMA) i urin. Ved α=0,05, 2 mål pr. forsøgsperson (baseline og post) og en korrelation på ρ=0,6 mellem målene, vil 25 deltagere give 80 % kraft til at detektere en 0,6 SD-stigning i NDMA-koncentrationen. For at give mulighed for en tilbagetrækningsrate på 10 % planlægger vi at rekruttere 25 deltagere til undersøgelsen. En rullende rekruttering af deltagere vil blive udført, indtil stikprøvestørrelsen er nået.

Statistiske metoder

Statistiske analyser vil blive udført ved hjælp af IBM SPSS Statistics for Windows, version 25 (IBM) og STATA/IC 17.0 (StataCorp LLC). Beskrivende statistik over normalfordelte kontinuerte variable vil blive udtrykt som middelværdi (± standardafvigelse, SD), ikke-normalfordelte kontinuerte variabler som median (interkvartilområde, IQR) og kategoriske variable som antal (proportion, %). Data vil blive vurderet for outliers og normalitet forud for analyse. Ikke-normalt distribuerede data vil blive logtransformeret, hvis det er nødvendigt. Behandlingseffekter for resultater vil blive opnået ved brug af lineære blandede modeller, herunder baseline målinger, behandlingsrækkefølge, periode og tid (som en kategorisk variabel) som faste effekter. Vi vil også inkludere et interaktionsudtryk for behandling X periode for at vurdere for mulige behandlingsperiode interaktioner og vil separat vurdere for overførselseffekter med dummy-variabler for at angive den tidligere behandling. Behandlingseffekter for resultater med en enkelt post-interventionsmåling vil blive opnået ved brug af lineære blandede modeller, herunder baseline målinger, behandlingsrækkefølge og periode som prædiktorer. Emnets ID-nummer vil blive inkluderet som en tilfældig opsnapning i hver model. En samlet 2-sidet type 1 fejlrate på P<0,05 vil blive brugt til at vurdere statistisk signifikans for al hypotesetestning.