Nitrat INFORMER Water Study

Studiendesign

Es wird ein Crossover-Studiendesign mit einer einwöchigen Auswaschphase zwischen den Interventionen verwendet. Die Ernährung der Teilnehmer am Tag vor und am Tag der Intervention wird wie folgt standardisiert (die Lebensmittelauswahl bei Besuch 1 wird auf Besuch 2 abgestimmt):

Für den Tag vor dem Studienbesuch:

• Frühstück: Weißbrottoast mit Eiern, Käse, Erdnussbutter oder Marmelade.
• Zum Mittagessen gibt es Kürbissuppe und Weißbrot
• Abendessen: ein nitratarmes vegetarisches Gericht
• Alles Wasser wird zur Verfügung gestellt
• Die Teilnehmer werden gebeten, 24 Stunden vor ihrem Studienbesuch keinen Kaffee oder koffeinhaltige Getränke 17 und keine alkoholischen Getränke 18 zu trinken und keine Übungen zu machen.

Für den Tag des Studienbesuchs:

• Die Teilnehmer kommen nüchtern zur Lerneinheit
• Das Frühstück besteht aus Weißbrottoast mit Käse, Erdnussbutter oder Marmelade zusammen mit der ersten Wasserintervention
• Das Mittagessen besteht aus Kürbissuppe und Weißbrot zusammen mit der zweiten Wasserintervention
• Die Teilnehmer erhalten ein standardisiertes Abendessen: eine nitratarme vegetarische Mahlzeit
• Alles Wasser wird zur Verfügung gestellt
• Die Teilnehmer werden gebeten, 24 Stunden vor ihrem Studienbesuch keinen Kaffee oder koffeinhaltige Getränke 17 und keine alkoholischen Getränke 18 zu trinken und keine Übungen zu machen.

Eingriffe

• Wasser mit zugesetztem Nitrat: 137 mg Natriumnitrat oder 164 mg Kaliumnitrat (100 mg Nitrat) in einer 500-ml-Wasserflasche (200 mg/l), zweimal bereitgestellt, einmal zum Frühstück und einmal zum Mittagessen. Dies entspricht insgesamt 200 mg Nitrat.

In Australien empfehlen 2011 veröffentlichte Richtlinien, dass Mengen unter 50 mg/L sicher getrunken werden können, Mengen von 50 - 100 mg/L sind für alle Erwachsenen, einschließlich schwangerer Frauen, aber nicht für Säuglinge unter 3 Monaten, sicher zu trinken Wasser mit Nitratkonzentrationen über 100 mg/l wird nicht empfohlen.

• Wasser ohne zugesetztes Nitrat: 137 mg Natriumchlorid oder 164 mg Kaliumchlorid in einer 500-ml-Wasserflasche, die zweimal bereitgestellt wird, einmal zum Frühstück und einmal zum Mittagessen.

Sequenzerstellung. Die Sequenz der Interventionszuordnung wird durch Blockrandomisierung mit computergenerierten Zufallszahlen generiert. Es werden zufällige Blockgrößen von 2 und 4 verwendet.

Verschleierungsmechanismus. Fünfzig zufällig generierte Sequenzen der Interventionen für jeden Studienteilnehmer werden von einem Studienleiter, der nicht an der Durchführung der Intervention, der Datenerhebung oder der Datenanalyse beteiligt ist, auf separate Blätter gedruckt und in undurchsichtigen Umschlägen versiegelt, die von 1 bis 50 nummeriert sind .

Implementierung. Sobald ein Teilnehmer als geeignet erachtet und in die Studie aufgenommen wurde, kontaktiert der Studienkoordinator den Studienprüfer, der für die Randomisierung und Interventionszuweisung verantwortlich ist, um den nächsten verfügbaren Umschlag und die zufällig generierte Interventionssequenz zu erhalten.

Blendung. Angesichts der Art der Interventionen werden die Teilnehmer und die für die Durchführung der Interventionen verantwortlichen Ermittler während der gesamten Studie entblindet. Alle Forscher, die die Laboranalysen und Datenanalysen durchführen, werden jedoch für die Interventionen, die die Teilnehmer erhielten, verblindet, bis die Datenanalyse durchgeführt wurde.

Zeitleiste der Teilnehmer. Vor dem ersten Klinikbesuch füllt jeder Teilnehmer einen Ernährungsfrequenzfragebogen (FFQ) aus, um die gewohnheitsmäßige Ernährung im Hintergrund zu beurteilen.

Bei jedem Besuch in der Klinik (Abbildung 1) wird eine Urin- und Stuhlprobe zu Studienbeginn zur Messung von N-Nitrosaminen entnommen. Vor dem Eingriff werden die Teilnehmer angewiesen, ihre Blase in den Ausgangs-Urinsammelbehälter zu entleeren. Nach dem ersten Eingriff wird der gesamte Urin für die folgenden 24 Stunden zur Messung von N-Nitrosaminen, Nitrat und Nitrit gesammelt. Zur Messung von N-Nitrosaminen, Nitrat und Nitrit wird ein Kotstuhl entnommen.

Bewertungen

Urin- und Kotabnahme. Eine Urinprobe wird zu Studienbeginn und von der Intervention bis 24 Stunden nach der Intervention gesammelt. Für die Basisprobe erhalten die Teilnehmer einen sterilisierten Behälter und Anweisungen, die erste Urinprobe des Tages zu entsorgen und dann den gesamten Urin bis zum Eingriff zu sammeln, der in die Klinik gebracht wird. Die Teilnehmer werden angewiesen, nach dem Aufwachen 250 ml Wasser zu trinken. Für die 24-Stunden-Urinproben erhalten die Teilnehmer sterilisierte Behälter und Anweisungen, den gesamten Urin bis 24 Stunden nach dem Eingriff zu sammeln. Urinaliquots werden bis zur Analyse bei -80 °C eingefroren. Zu Studienbeginn und für die 24 Stunden nach dem ersten Eingriff wird eine Stuhlprobe entnommen. Die Teilnehmer erhalten Anweisungen und ein Stuhlprobenentnahmepaket (Sammelbeutel, Kabelbinder, große Reißverschlussbeutel, Gefriereisblöcke und eine spezielle Kühltasche für den Transport). Gesammelte Stuhlproben werden gewogen und bis zur Analyse bei -80 °C eingefroren.

N-Nitrosamine. Nitrosamine in den Interventions-, Urin- und Stuhlproben werden mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS) gemessen. Flüchtige Nitrosamine werden mit Dichlormethan extrahiert und gut gaschromatographisch getrennt. Die Identifizierung erfolgt anhand der Retentionszeit und eindeutiger Molekülionen für jedes der fünf gängigen Nitrosamine. Die Quantifizierung erfolgt unter Verwendung von mit Deuterium markierten internen Standards, N-Nitrosodimethylamin-D6; N-Nitrosodiethylamin D10; N-Nitrosomorpholin D8 (Cambridge Isotopes) und N-Nitrosopiperidin D10 (Toronto Research Chemicals). Die am häufigsten nachgewiesenen Nitrosamine sind NDMA und N-Nitrosopiperidin (NPIP). Kontrollexperimente, bei denen Wasser, das in den gleichen Behältern gelagert wird, die für die Probenentnahme und -lagerung verwendet werden, durchgeführt werden, um zu testen, ob flüchtige Nitrosamine ausgelaugt werden.

Stichprobengröße und Macht

Die Stichprobengröße basiert auf einem Crossover-Design und dem primären Ergebnis von N-Nitrosaminen, insbesondere N-Nitrosodimethylamin (NDMA) im Urin. Bei α = 0,05, 2 Messungen pro Person (Baseline und Post) und einer Korrelation von ρ = 0,6 zwischen den Messungen liefern 25 Teilnehmer 80 % Power, um einen Anstieg der NDMA-Konzentration um 0,6 SD zu erkennen. Um eine Entzugsrate von 10 % zu ermöglichen, planen wir, 25 Teilnehmer für die Studie zu rekrutieren. Es wird eine rollierende Rekrutierung von Teilnehmern durchgeführt, bis die Stichprobengröße erreicht ist.

statistische Methoden

Statistische Analysen werden mit IBM SPSS Statistics für Windows, Version 25 (IBM) und STATA/IC 17.0 (StataCorp LLC) durchgeführt. Deskriptive Statistiken normalverteilter kontinuierlicher Variablen werden als Mittelwert (± Standardabweichung, SD), nicht normalverteilte kontinuierliche Variablen als Median (Interquartilbereich, IQR) und kategoriale Variablen als Zahl (Anteil, %) ausgedrückt. Die Daten werden vor der Analyse auf Ausreißer und Normalität untersucht. Nicht normalverteilte Daten werden bei Bedarf logtransformiert. Behandlungseffekte für Ergebnisse werden unter Verwendung von linearen gemischten Modellen erhalten, die Baseline-Messungen, Behandlungsreihenfolge, Zeitraum und Zeit (als kategoriale Variable) als feste Effekte enthalten. Wir werden auch einen Wechselwirkungsterm für den Zeitraum Behandlung X aufnehmen, um mögliche Wechselwirkungen während des Behandlungszeitraums zu bewerten, und wir werden separat auf Übertragungseffekte mit Dummy-Variablen bewerten, um die vorherige Behandlung anzuzeigen. Behandlungseffekte für Ergebnisse mit einer einzigen Post-Interventions-Messung werden unter Verwendung von linearen gemischten Modellen einschließlich Baseline-Messungen, Behandlungsreihenfolge und Zeitraum als Prädiktoren erhalten. Die Probanden-ID-Nummer wird als zufälliger Abschnitt in jedes Modell aufgenommen. Eine allgemeine zweiseitige Typ-1-Fehlerrate von P < 0,05 wird verwendet, um die statistische Signifikanz für alle Hypothesentests zu bewerten.