Nitrato INFORMER Water Study

Design de estudo

Um desenho de estudo cruzado será usado com um período de washout de 1 semana entre as intervenções. A dieta dos participantes no dia anterior e no dia da intervenção será padronizada (as escolhas alimentares na visita 1 serão iguais às da visita 2) da seguinte forma:

No dia anterior à visita de estudo:

• Café da manhã: torrada de pão branco com ovos, queijo, manteiga de amendoim ou geléia.
• O almoço será composto por sopa de abóbora e pão branco
• Jantar: uma refeição vegetariana com baixo teor de nitrato
• Toda a água será fornecida
• Os participantes serão solicitados a abster-se de beber qualquer café ou bebidas que contenham cafeína 17 e qualquer bebida alcoólica 18 e fazer qualquer exercício 24 horas antes de sua visita de estudo.

Para o dia da visita de estudo:

• Os participantes chegarão à unidade de estudo em jejum
• O café da manhã será composto por torradas de pão branco com queijo, manteiga de amendoim ou geléia juntamente com a primeira intervenção de água
• O almoço será composto por sopa de abóbora e pão branco juntamente com a segunda intervenção de água
• Os participantes receberão um jantar padronizado: uma refeição vegetariana com baixo teor de nitrato
• Toda a água será fornecida
• Os participantes serão solicitados a abster-se de beber qualquer café ou bebidas que contenham cafeína 17 e qualquer bebida alcoólica 18 e fazer qualquer exercício 24 horas antes de sua visita de estudo.

Intervenções

• Água com adição de nitrato: 137 mg de nitrato de sódio ou 164 mg de nitrato de potássio (100 mg de nitrato) em uma garrafa de água de 500 mL (200 mg/L) fornecida duas vezes, uma no café da manhã e outra no almoço. Isso é equivalente a 200 mg de nitrato no total.

Na Austrália, as diretrizes publicadas em 2011 recomendam que níveis inferiores a 50 mg/L são seguros para beber, níveis de 50 - 100 mg/L são seguros para todos os adultos, incluindo mulheres grávidas, mas não bebês com menos de 3 meses de idade, bebendo água com concentrações de nitrato superiores a 100 mg/L não é recomendada.

• Água sem adição de nitrato: 137 mg de cloreto de sódio ou 164 mg de cloreto de potássio em uma garrafa de água de 500 mL fornecida duas vezes, uma no café da manhã e outra no almoço.

Geração de sequência. A sequência de alocação da intervenção será gerada por meio de randomização de blocos usando números aleatórios gerados por computador. Tamanhos de blocos aleatórios de 2 e 4 serão usados.

Mecanismo de ocultação. Cinquenta sequências geradas aleatoriamente das intervenções para cada um dos participantes do estudo serão impressas em pedaços de papel separados e seladas em envelopes opacos, numerados de 1 a 50, por um investigador do estudo não envolvido na execução da intervenção, na coleta de dados ou na análise de dados .

Implementação. Assim que um participante for considerado elegível e inscrito no estudo, o coordenador do estudo entrará em contato com o investigador do estudo responsável pela randomização e alocação da intervenção para obter o próximo envelope disponível e a sequência de intervenção gerada aleatoriamente.

Cega. Dada a natureza das intervenções, os participantes e os investigadores responsáveis ​​pela realização das intervenções não serão cegados durante todo o estudo. No entanto, todos os pesquisadores que realizam as análises de laboratório e análises de dados estarão cegos para as intervenções que os participantes receberam até que a análise de dados tenha sido realizada.

Linha do tempo do participante. Antes da primeira visita clínica, cada participante preencherá um questionário de frequência alimentar (FFQ) para avaliar a dieta habitual de fundo.

Em cada visita clínica (Figura 1), uma amostra inicial de urina e fezes será coletada para medição de N-nitrosaminas. Antes da intervenção, os participantes serão instruídos a esvaziar a bexiga no recipiente de coleta de urina inicial. Após a primeira intervenção, toda a urina do período subsequente de 24 horas será coletada para dosagem de N-nitrosaminas, nitrato e nitrito. As fezes serão coletadas para medição de N-nitrosaminas, nitrato e nitrito.

Avaliações

Coleta de urina e fezes. Uma amostra de urina será coletada no início e da intervenção até 24 horas após a intervenção. Para a amostra de linha de base, os participantes receberão um recipiente esterilizado e instruções para descartar a primeira amostra de urina do dia e depois coletar toda a urina até a intervenção que será trazida para a clínica. Os participantes serão instruídos a beber 250 ml de água ao acordar. Para as amostras de urina de 24 horas, os participantes receberão recipientes esterilizados e instruções para coletar toda a urina até 24 horas após a intervenção. Alíquotas de urina serão congeladas a -80°C até a análise. Uma amostra de fezes será coletada no início e durante o período de 24 horas após a primeira intervenção. Os participantes receberão instruções e um pacote de coleta de amostras de fezes (sacos de coleta, abraçadeiras, sacos grandes com zíper, blocos de gelo para freezer e um saco térmico designado para transporte). As amostras de fezes coletadas serão pesadas e congeladas a -80°C até a análise.

N-nitrosaminas. Nitrosaminas nas intervenções, amostras de urina e fezes serão dosadas por espectrometria de massa por cromatografia gasosa (GCMS). Nitrosaminas voláteis serão extraídas com diclorometano e bem separadas por cromatografia gasosa. A identificação será por tempo de retenção e íons moleculares únicos para cada uma das cinco nitrosaminas comuns. A quantificação será feita usando padrões internos marcados com deutério, N-nirtrosodimetilamina-D6; N-nitrosodietilamina D10; N-nitrosomorfolina D8 (Cambridge Isotopes) e N-nitrosopiperidina D10 (Toronto Research Chemicals). As nitrosaminas mais comumente detectadas são NDMA e N-Nitrosopiperidina (NPIP). Experimentos de controle nos quais a água armazenada nos mesmos recipientes usados ​​para coleta e armazenamento de amostras será realizada para testar qualquer lixiviação de nitrosaminas voláteis.

Tamanho e poder da amostra

O tamanho da amostra é baseado em um desenho cruzado e no resultado primário de N-nitrosaminas, especificamente N-Nitrosodimetilamina (NDMA) na urina. Em α=0,05, 2 medidas por sujeito (linha de base e pós) e uma correlação de ρ=0,6 entre as medidas, 25 participantes fornecerão 80% de poder para detectar um aumento de 0,6 DP na concentração de NDMA. Para permitir uma taxa de retirada de 10%, planejamos recrutar 25 participantes para o estudo. Um recrutamento contínuo de participantes será realizado até que o tamanho da amostra seja atingido.

Métodos estatísticos

As análises estatísticas serão realizadas usando o IBM SPSS Statistics for Windows, versão 25 (IBM) e STATA/IC 17.0 (StataCorp LLC). Estatísticas descritivas de variáveis ​​contínuas normalmente distribuídas serão expressas como média (± desvio padrão, DP), variáveis ​​contínuas não normalmente distribuídas como mediana (intervalo interquartil, IQR) e variáveis ​​categóricas como número (proporção, %). Os dados serão avaliados quanto a outliers e normalidade antes da análise. Dados não distribuídos normalmente serão transformados em log, se necessário. Os efeitos do tratamento para os resultados serão obtidos usando modelos mistos lineares, incluindo medidas de linha de base, ordem de tratamento, período e tempo (como uma variável categórica) como efeitos fixos. Também incluiremos um termo de interação tratamento X período para avaliar possíveis interações tratamento-período e avaliaremos separadamente os efeitos de transferência com variáveis ​​fictícias para indicar o tratamento anterior. Os efeitos do tratamento para resultados com uma única medição pós-intervenção serão obtidos usando modelos lineares mistos, incluindo medições de linha de base, ordem de tratamento e período como preditores. O número de ID do sujeito será incluído como uma interceptação aleatória em cada modelo. Uma taxa de erro tipo 1 bilateral geral de P<0,05 será usada para avaliar a significância estatística para todos os testes de hipótese.