Nitrat INFORMER Vannstudie

Studere design

Et crossover studiedesign vil bli brukt med en 1 ukes utvaskingsperiode mellom intervensjonene. Deltakernes diett for dagen før og dagen for intervensjonen vil bli standardisert (matvalg på besøk 1 vil bli matchet for besøk 2) som følger:

For dagen før studiebesøket:

• Frokost: toast med hvitt brød med egg, ost, peanøttsmør eller syltetøy.
• Det vil bli servert lunsj med gresskarsuppe og hvitt brød
• Middag: et vegetarisk måltid med lavt nitratinnhold
• Alt vann vil bli gitt
• Deltakerne vil bli bedt om å avstå fra å drikke kaffe eller koffein som inneholder drikker 17 og alkoholholdig drikke 18 og gjøre enhver trening 24 timer før studiebesøket.

For studiebesøksdagen:

• Deltakerne kommer fastende til studieenheten
• Frokosten vil bestå av hvitt brødtoast med ost, peanøttsmør eller syltetøy sammen med den første vannintervensjonen
• Lunsj vil bestå av gresskarsuppe og hvitt brød sammen med den andre vannintervensjonen
• Deltakerne vil få en standardisert middag: et vegetarisk måltid med lavt nitratnivå
• Alt vann vil bli gitt
• Deltakerne vil bli bedt om å avstå fra å drikke kaffe eller koffein som inneholder drikker 17 og alkoholholdig drikke 18 og gjøre enhver trening 24 timer før studiebesøket.

Intervensjoner

• Vann tilsatt nitrat: 137 mg natriumnitrat eller 164 mg kaliumnitrat (100 mg nitrat) i en 500 ml vannflaske (200 mg/L) levert to ganger, en med frokost og en med lunsj. Dette tilsvarer totalt 200 mg nitrat.

I Australia anbefaler retningslinjer publisert i 2011 at nivåer mindre enn 50 mg/L er trygge å drikke, nivåer på 50 - 100 mg/L er trygge å drikke for alle voksne, inkludert gravide kvinner, men ikke spedbarn under 3 måneder gamle, drikking vann med nitratkonsentrasjoner større enn 100 mg/L anbefales ikke.

• Vann uten tilsatt nitrat: 137 mg natriumklorid eller 164 mg kaliumklorid i en 500 ml vannflaske levert to ganger, en med frokost og en med lunsj.

Sekvensgenerering. Rekkefølgen for intervensjonstildeling vil bli generert via blokkrandomisering ved bruk av datagenererte tilfeldige tall. Tilfeldige blokkstørrelser på 2 og 4 vil bli brukt.

Skjulningsmekanisme. Femti tilfeldig genererte sekvenser av intervensjonene for hver av studiedeltakerne vil bli skrevet ut på separate stykker papir og forseglet i ugjennomsiktige konvolutter, nummerert 1-50, av en studieetterforsker som ikke er involvert i å utføre intervensjonen, datainnsamlingen eller dataanalysen .

Gjennomføring. Når en deltaker er ansett som kvalifisert og registrert i studien, vil studiekoordinatoren kontakte studieutforskeren som er ansvarlig for randomisering og intervensjonstildeling for å få den neste tilgjengelige konvolutten og tilfeldig genererte intervensjonssekvens.

Blinding. Gitt arten av intervensjonene, vil deltakerne og etterforskerne som er ansvarlige for å levere intervensjonene være ublindet gjennom hele forsøket. Alle forskere som utfører laboratorieanalysene og dataanalysene vil imidlertid bli blindet for intervensjonene som deltakerne mottok før etter at dataanalysen er utført.

Tidslinje for deltakere. Før det første klinikkbesøket vil hver deltaker fylle ut et spørreskjema for matfrekvens (FFQ) for å vurdere vanlig kosthold i bakgrunnen.

Ved hvert klinikkbesøk (Figur 1) vil en baseline urin- og avføringsprøve bli samlet inn for måling av N-nitrosaminer. Før intervensjonen vil deltakerne bli instruert om å tømme blæren i urinoppsamlingsbeholderen ved baseline. Etter den første intervensjonen vil all urin for den påfølgende 24-timersperioden bli samlet for måling av N-nitrosaminer, nitrat og nitritt. En fekal avføring vil bli samlet for måling av N-nitrosaminer, nitrat og nitritt.

Vurderinger

Oppsamling av urin og avføring. En urinprøve vil bli tatt ved baseline, og fra intervensjon til 24 timer etter intervensjon. For grunnlinjeprøven vil deltakerne få en sterilisert beholder og instruksjoner om å kaste dagens første urinprøve og deretter samle opp all urin frem til intervensjonen som skal bringes inn i klinikken. Deltakerne vil bli bedt om å drikke 250 ml vann når de våkner. For 24-timers urinprøver vil deltakerne få steriliserte beholdere og instruksjoner for å samle opp all urin inntil 24 timer etter intervensjon. Urinalikvoter vil bli frosset ved -80°C frem til analyse. En avføringsprøve vil bli tatt ved baseline og i 24-timersperioden etter første intervensjon. Deltakerne vil få instruksjoner og en prøvetakingspakke for avføring (samleposer, buntebånd, store zip-låsposer, fryseisblokker og en egen kjølebag for transport). Innsamlede avføringsprøver veies og fryses ved -80°C frem til analyse.

N-nitrosaminer. Nitrosaminer i intervensjonene, urin og avføringsprøver vil bli målt ved gasskromatografi massespektrometri (GCMS). Flyktige nitrosaminer vil bli ekstrahert med diklormetan og separeres godt ved gasskromatografi. Identifikasjon vil være ved retensjonstid og unike molekylære ioner for hver av fem vanlige nitrosaminer. Kvantifisering vil bli gjort ved å bruke deuteriummerkede interne standarder, N-nirtrosodimethylamine-D6; N-nitrosodietylamin D10; N-nitrosomorfolin D8 (Cambridge-isotoper) og N-nitrosopiperidin D10 (Toronto Research Chemicals). De mest påviste nitrosaminene er NDMA og N-Nitrosopiperidin (NPIP). Kontrolleksperimenter hvor vann lagret i samme beholdere som brukes til prøvetaking og lagring vil bli utført for å teste for eventuell utlekking av flyktige nitrosaminer.

Prøvestørrelse og kraft

Prøvestørrelse er basert på en crossover-design og det primære resultatet av N-nitrosaminer, spesielt N-Nitrosodimetylamin (NDMA) i urin. Ved α=0,05, 2 mål per forsøksperson (grunnlinje og post) og en korrelasjon på ρ=0,6 mellom målene, vil 25 deltakere gi 80 % kraft til å oppdage en 0,6 SD-økning i NDMA-konsentrasjon. For å tillate en uttaksrate på 10 %, planlegger vi å rekruttere 25 deltakere til studien. En rullerende rekruttering av deltakere vil bli utført inntil utvalgsstørrelsen er nådd.

statistiske metoder

Statistiske analyser vil bli utført ved å bruke IBM SPSS Statistics for Windows, versjon 25 (IBM) og STATA/IC 17.0 (StataCorp LLC). Beskrivende statistikk over normalfordelte kontinuerlige variabler vil uttrykkes som gjennomsnitt (± standardavvik, SD), ikke-normalfordelte kontinuerlige variabler som median (interkvartilområde, IQR) og kategoriske variabler som antall (proporsjon, %). Data vil bli vurdert for uteliggere og normalitet før analyse. Ikke-normalfordelte data vil bli loggtransformert om nødvendig. Behandlingseffekter for utfall vil bli oppnådd ved bruk av lineære blandede modeller inkludert baseline målinger, behandlingsrekkefølge, periode og tid (som en kategorisk variabel) som faste effekter. Vi vil også inkludere en interaksjonsperiode for behandling X periode for å vurdere mulige interaksjoner i behandlingsperiode og vil separat vurdere for overføringseffekter med dummyvariabler for å indikere den forrige behandlingen. Behandlingseffekter for utfall med en enkelt post-intervensjonsmåling vil bli oppnådd ved å bruke lineære blandede modeller inkludert baseline-målinger, behandlingsrekkefølge og periode som prediktorer. Emnets ID-nummer vil bli inkludert som et tilfeldig avskjæring i hver modell. En samlet 2-sidig type-1 feilrate på P<0,05 vil bli brukt for å vurdere statistisk signifikans for all hypotesetesting.