Нитрат ИНФОРМЕР Исследование воды

Дизайн исследования

Будет использоваться дизайн перекрестного исследования с 1-недельным периодом вымывания между вмешательствами. Диета участников накануне и в день вмешательства будет стандартизирована (выбор продуктов во время визита 1 будет таким же, как и во время визита 2) следующим образом:

За день до учебного визита:

• Завтрак: тост из белого хлеба с яйцами, сыром, арахисовым маслом или джемом.
• Обед будет состоять из тыквенного супа и белого хлеба.
• Ужин: вегетарианская еда с низким содержанием нитратов.
• Вся вода будет предоставлена
• Участникам будет предложено воздержаться от употребления кофе или напитков, содержащих кофеин 17 , и любых алкогольных напитков 18 , а также выполнять какие-либо физические упражнения за 24 часа до исследовательского визита.

В день ознакомительного визита:

• Участники прибудут в исследовательский блок натощак.
• Завтрак будет состоять из тостов из белого хлеба с сыром, арахисовым маслом или джемом вместе с первым введением воды.
• Обед будет состоять из тыквенного супа и белого хлеба вместе со вторым водным вмешательством.
• Участникам будет предоставлен стандартный ужин: вегетарианская еда с низким содержанием нитратов.
• Вся вода будет предоставлена
• Участникам будет предложено воздержаться от употребления кофе или напитков, содержащих кофеин 17 , и любых алкогольных напитков 18 , а также выполнять какие-либо физические упражнения за 24 часа до исследовательского визита.

Вмешательства

• Вода с добавлением нитратов: 137 мг нитрата натрия или 164 мг нитрата калия (100 мг нитрата) в бутылке с водой на 500 мл (200 мг/л) дважды, один раз за завтраком и один раз за обедом. Это эквивалентно 200 мг нитратов.

В Австралии в руководящих принципах, опубликованных в 2011 г., рекомендуется, чтобы уровни менее 50 мг/л были безопасны для питья, а уровни 50–100 мг/л безопасны для всех взрослых, включая беременных женщин, но не младенцев в возрасте до 3 месяцев, употребляющих алкоголь. вода с концентрацией нитратов более 100 мг/л не рекомендуется.

• Вода без добавления нитратов: 137 мг хлорида натрия или 164 мг хлорида калия в бутылке с водой на 500 мл дважды, один раз за завтраком и один раз за обедом.

Генерация последовательности. Последовательность распределения вмешательств будет генерироваться путем рандомизации блоков с использованием случайных чисел, сгенерированных компьютером. Будут использоваться случайные размеры блоков 2 и 4.

Механизм сокрытия. Пятьдесят случайно сгенерированных последовательностей вмешательств для каждого из участников исследования будут распечатаны на отдельных листах бумаги и запечатаны в непрозрачные конверты, пронумерованные от 1 до 50, исследователем, не участвующим в проведении вмешательства, сборе данных или анализе данных. .

Выполнение. Как только участник будет признан подходящим и включенным в исследование, координатор исследования свяжется с исследователем исследования, ответственным за рандомизацию и распределение вмешательств, чтобы получить следующий доступный пакет и случайно сгенерированную последовательность вмешательств.

Ослепление. Учитывая характер вмешательств, участники и исследователи, ответственные за проведение вмешательств, не будут ослеплены на протяжении всего испытания. Однако все исследователи, выполняющие лабораторные анализы и анализ данных, не будут знать о вмешательстве, которое получили участники, до тех пор, пока не будет проведен анализ данных.

График участников. Перед первым визитом в клинику каждый участник заполнит анкету частоты приема пищи (FFQ) для оценки привычного рациона питания.

При каждом визите в клинику (рис. 1) будет собираться исходный образец мочи и кала для измерения N-нитрозаминов. Перед вмешательством участников проинструктируют опорожнить мочевой пузырь в контейнер для сбора исходной мочи. После первого вмешательства вся моча в последующие 24 часа будет собираться для измерения N-нитрозаминов, нитратов и нитритов. Фекальный стул будет собран для измерения N-нитрозаминов, нитратов и нитритов.

Оценки

Сбор мочи и кала. Образец мочи будет собираться на исходном уровне и с момента вмешательства до 24 часов после вмешательства. Для исходного образца участникам будет предоставлен стерилизованный контейнер и инструкции по утилизации первого образца мочи за день, а затем собрать всю мочу до вмешательства, которое будет доставлено в клинику. Участникам будет предложено выпить 250 мл воды после пробуждения. Для 24-часовых образцов мочи участникам будут предоставлены стерилизованные контейнеры и инструкции по сбору всей мочи в течение 24 часов после вмешательства. Аликвоты мочи будут заморожены при температуре -80°C до проведения анализа. Образец стула будет собран на исходном уровне и в течение 24 часов после первого вмешательства. Участникам будут предоставлены инструкции и пакет для сбора образцов стула (пакеты для сбора, кабельные стяжки, большие пакеты с замком на молнии, блоки льда для замораживания и специальная сумка-холодильник для транспортировки). Собранные образцы стула будут взвешены и заморожены при -80°C до проведения анализа.

N-нитрозамины. Нитрозамины в образцах вмешательств, мочи и стула будут измеряться с помощью газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХМС). Летучие нитрозамины экстрагируются дихлорметаном и хорошо отделяются газовой хроматографией. Идентификация будет осуществляться по времени удерживания и уникальным молекулярным ионам для каждого из пяти распространенных нитрозаминов. Количественное определение будет производиться с использованием внутренних стандартов, меченных дейтерием, N-нитрозодиметиламина-D6; N-нитрозодиэтиламин D10; N-нитрозоморфолин D8 (Cambridge Isotopes) и N-нитрозопиперидин D10 (Toronto Research Chemicals). Наиболее часто обнаруживаемые нитрозамины — это NDMA и N-нитрозопиперидин (NPIP). Контрольные эксперименты, в которых вода хранится в тех же контейнерах, что и те, которые используются для сбора и хранения образцов, будут проводиться для проверки любого выщелачивания летучих нитрозаминов.

Размер выборки и мощность

Размер выборки основан на перекрестном дизайне и первичном исходе N-нитрозаминов, особенно N-нитрозодиметиламина (NDMA) в моче. При α = 0,05, 2 измерениях на субъекта (базовый уровень и после) и корреляции ρ = 0,6 между измерениями 25 участников обеспечат 80% мощности для обнаружения увеличения концентрации NDMA на 0,6 SD. Чтобы обеспечить 10-процентный коэффициент отказа, мы планируем привлечь к исследованию 25 участников. Повторный набор участников будет осуществляться до тех пор, пока не будет достигнут размер выборки.

Статистические методы

Статистический анализ будет выполняться с использованием IBM SPSS Statistics для Windows версии 25 (IBM) и STATA/IC 17.0 (StataCorp LLC). Описательная статистика нормально распределенных непрерывных переменных будет выражаться как среднее (± стандартное отклонение, SD), ненормально распределенных непрерывных переменных как медиана (межквартильный размах, IQR) и категориальных переменных как число (доля, %). Перед анализом данные будут оцениваться на предмет выбросов и нормальности. При необходимости данные с ненормальным распределением будут логарифмически преобразованы. Эффекты лечения для результатов будут получены с использованием линейных смешанных моделей, включающих базовые измерения, порядок лечения, период и время (как категориальную переменную) в качестве фиксированных эффектов. Мы также включим термин взаимодействия периода лечения X для оценки возможных взаимодействий периода лечения и отдельно оценим эффекты переноса с фиктивными переменными, чтобы указать предыдущее лечение. Эффекты лечения для результатов с одним измерением после вмешательства будут получены с использованием линейных смешанных моделей, включающих базовые измерения, порядок лечения и период в качестве предикторов. Идентификационный номер субъекта будет включен в качестве случайного перехвата в каждую модель. Общая двусторонняя частота ошибок типа 1 P<0,05 будет использоваться для оценки статистической значимости для всех проверок гипотез.