Nitrat INFORMER Vattenstudie

Studera design

En crossover-studiedesign kommer att användas med en 1 veckas tvättperiod mellan interventionerna. Deltagarnas kost för dagen före och dagen för interventionen kommer att standardiseras (matval vid besök 1 kommer att matchas för besök 2) enligt följande:

För dagen före studiebesöket:

• Frukost: vitt brödrostat bröd med ägg, ost, jordnötssmör eller sylt.
• Lunch serveras med pumpasoppa och vitt bröd
• Middag: en vegetarisk måltid med låg nitrathalt
• Allt vatten kommer att tillhandahållas
• Deltagarna kommer att uppmanas att avstå från att dricka kaffe eller koffein som innehåller drycker 17 och alkoholhaltiga drycker 18 och att göra någon motion 24 timmar före studiebesöket.

För dagen för studiebesöket:

• Deltagarna kommer fastande till studieenheten
• Frukosten består av vitt brödrostat bröd med ost, jordnötssmör eller sylt tillsammans med den första vatteninsatsen
• Lunchen består av pumpasoppa och vitt bröd tillsammans med den andra vatteninsatsen
• Deltagarna kommer att förses med en standardiserad middag: en vegetarisk måltid med låg nitrathalt
• Allt vatten kommer att tillhandahållas
• Deltagarna kommer att uppmanas att avstå från att dricka kaffe eller koffein som innehåller drycker 17 och alkoholhaltiga drycker 18 och att göra någon motion 24 timmar före studiebesöket.

Interventioner

• Vatten med tillsatt nitrat: 137 mg natriumnitrat eller 164 mg kaliumnitrat (100 mg nitrat) i en 500 ml vattenflaska (200 mg/L) två gånger, en med frukost och en med lunch. Detta motsvarar totalt 200 mg nitrat.

I Australien rekommenderar riktlinjer publicerade 2011 att nivåer mindre än 50 mg/L är säkra att dricka, nivåer på 50 - 100 mg/L är säkra att dricka för alla vuxna inklusive gravida kvinnor men inte spädbarn under 3 månaders ålder, drickande vatten med nitratkoncentrationer över 100 mg/L rekommenderas inte.

• Vatten utan tillsatt nitrat: 137 mg natriumklorid eller 164 mg kaliumklorid i en 500 ml vattenflaska två gånger, en med frukost och en med lunch.

Sekvensgenerering. Sekvensen av interventionstilldelning kommer att genereras via blockrandomisering med hjälp av datorgenererade slumptal. Slumpmässiga blockstorlekar 2 och 4 kommer att användas.

Döljande mekanism. Femtio slumpmässigt genererade sekvenser av interventionerna för var och en av studiedeltagarna kommer att skrivas ut på separata papperslappar och förseglas i ogenomskinliga kuvert, numrerade 1-50, av en studieutredare som inte är involverad i att utföra interventionen, datainsamlingen eller dataanalysen .

Genomförande. När en deltagare bedöms vara berättigad och registrerad i studien kommer studiekoordinatorn att kontakta studieutredaren som ansvarar för randomisering och interventionstilldelning för att få nästa tillgängliga kuvert och slumpmässigt genererade interventionssekvens.

Bländande. Med tanke på arten av interventionerna kommer deltagarna och utredarna som ansvarar för att utföra interventionerna att vara avblindade under hela försöket. Alla forskare som utför laboratorieanalyserna och dataanalyserna kommer dock att bli blinda för de insatser som deltagarna fått tills efter att dataanalysen har utförts.

Tidslinje för deltagare. Före det första klinikbesöket kommer varje deltagare att fylla i ett frågeformulär för matfrekvens (FFQ) för att bedöma bakgrundsvanemässig kost.

Vid varje klinikbesök (Figur 1) kommer ett baslinjeprov av urin och avföring att samlas in för mätning av N-nitrosaminer. Före interventionen kommer deltagarna att instrueras att tömma sin urinblåsa i baslinjeurinsamlingsbehållaren. Efter den första interventionen kommer all urin för den efterföljande 24-timmarsperioden att samlas upp för mätning av N-nitrosaminer, nitrat och nitrit. En fekal avföring kommer att samlas in för mätning av N-nitrosaminer, nitrat och nitrit.

Bedömningar

Urin- och fekal avföring. Ett urinprov kommer att tas vid baslinjen och från intervention upp till 24 timmar efter intervention. För baslinjeprovet kommer deltagarna att förses med en steriliserad behållare och instruktioner om att kassera dagens första urinprov och sedan samla upp all urin fram till interventionen som kommer att föras in till kliniken. Deltagarna kommer att instrueras att dricka 250 ml vatten när de vaknar. För 24-timmarsurinproverna kommer deltagarna att förses med steriliserade behållare och instruktioner för att samla upp all urin fram till 24 timmar efter intervention. Urinalikvoter kommer att frysas vid -80°C fram till analys. Ett avföringsprov kommer att samlas in vid baslinjen och under 24 timmar efter den första interventionen. Deltagarna kommer att få instruktioner och ett provuppsamlingspaket (uppsamlingspåsar, buntband, stora zip-låspåsar, frysisblock och en avsedd kylväska för transport). Insamlade avföringsprover kommer att vägas och frysas vid -80°C fram till analys.

N-nitrosaminer. Nitrosaminer i ingreppen, urin och avföringsprover kommer att mätas med gaskromatografi masspektrometri (GCMS). Flyktiga nitrosaminer kommer att extraheras med diklormetan och separeras väl genom gaskromatografi. Identifiering kommer att ske genom retentionstid och unika molekylära joner för var och en av fem vanliga nitrosaminer. Kvantifiering kommer att göras genom att använda deuteriummärkta interna standarder, N-nirtrosodimetylamin-D6; N-nitrosodietylamin D10; N-nitrosomorfolin D8 (Cambridge Isotoper) och N-nitrosopiperidin D10 (Toronto Research Chemicals). De vanligaste detekterade nitrosaminerna är NDMA och N-Nitrosopiperidin (NPIP). Kontrollexperiment där vatten som lagras i samma behållare som de som används för provtagning och lagring kommer att utföras för att testa för eventuellt läckage av flyktiga nitrosaminer.

Provstorlek och kraft

Provstorleken är baserad på en crossover-design och det primära resultatet av N-nitrosaminer, särskilt N-Nitrosodimetylamin (NDMA) i urin. Vid α=0,05, 2 åtgärder per försöksperson (baslinje och post) och en korrelation på ρ=0,6 mellan åtgärderna, kommer 25 deltagare att ge 80 % kraft för att upptäcka en 0,6 SD-ökning i NDMA-koncentration. För att möjliggöra en uttagsfrekvens på 10 % planerar vi att rekrytera 25 deltagare till studien. En rullande rekrytering av deltagare kommer att genomföras tills urvalsstorleken uppnås.

Statistiska metoder

Statistiska analyser kommer att utföras med hjälp av IBM SPSS Statistics för Windows, version 25 (IBM) och STATA/IC 17.0 (StataCorp LLC). Beskrivande statistik över normalfördelade kontinuerliga variabler kommer att uttryckas som medelvärde (± standardavvikelse, SD), icke-normalfördelade kontinuerliga variabler som median (interkvartilintervall, IQR) och kategoriska variabler som antal (proportion, %). Data kommer att bedömas för extremvärden och normalitet före analys. Icke-normalt distribuerad data kommer att logtransformeras vid behov. Behandlingseffekter för resultat kommer att erhållas med hjälp av linjära blandade modeller inklusive baslinjemätningar, behandlingsordning, period och tid (som en kategorisk variabel) som fasta effekter. Vi kommer också att inkludera en interaktionsperiod för behandling X period för att bedöma för möjliga behandlingsperiodinteraktioner och kommer separat att bedöma för överföringseffekter med dummyvariabler för att indikera den tidigare behandlingen. Behandlingseffekter för resultat med en enda mätning efter intervention kommer att erhållas med hjälp av linjära blandade modeller inklusive baslinjemätningar, behandlingsordning och period som prediktorer. Ämnes-ID-numret kommer att inkluderas som en slumpmässig intercept i varje modell. En övergripande dubbelsidig typ 1-felfrekvens på P<0,05 kommer att användas för att bedöma statistisk signifikans för all hypotestestning.