Charakteristiky, které identifikují riziko exacerbace po nachlazení u pacientů s CHOPN

Výzkumný protokol

Biomarkery a klinické charakteristiky, které identifikují riziko exacerbace po virových infekcích horních cest dýchacích u pacientů s CHOPN

Hlavní řešitel: Dr. Patrick Mallia Spoluřešitelé: Profesor Sebastian Johnston Dr. Sarah Elkin

Místo studie Studie bude probíhat v nemocnici St Mary's Hospital v Londýně, která je součástí Imperial College Healthcare NHS Trust.

1. Pozadí Exacerbace CHOPN jsou hlavní příčinou nákladů na zdravotní péči, morbidity a mortality. Současné terapie jsou pouze částečně účinné a mají značné vedlejší účinky, takže je naléhavě zapotřebí nové léčby. 40 – 50 % exacerbací CHOPN souvisí s virovými infekcemi a nejčastějšími detekovanými viry jsou rhinoviry a chřipka1,2. Nedávno byly k dispozici citlivé a rychlé diagnostické techniky pro virové infekce3 a byly vyvinuty léky účinné proti rinoviru a chřipce4, díky čemuž je antivirová terapie reálnou potenciální možností léčby exacerbací CHOPN. Naše chápání vztahu mezi virovými infekcemi a exacerbacemi CHOPN však zůstává omezené a před provedením zkoušek antivirové léčby je zapotřebí více informací.

Experimentální model exacerbace CHOPN Vyvinuli jsme model exacerbace CHOPN využívající experimentální rinovirovou infekci u pacientů s CHOPN, který nám umožňuje studovat řadu výsledků pečlivě kontrolovaným způsobem, který není možný u přirozeně se vyskytujících infekcí5,6. Tento model poskytl nová data týkající se vztahů mezi virovou infekcí a exacerbacemi. Po infekci rhinovirem se u subjektů vyvinuly příznaky infekce horních cest dýchacích (URTI), které začaly 2. den po inokulaci a vrcholily 4. den, následovaly typické příznaky akutní exacerbace dolních cest dýchacích, které začaly 5. den a vrcholily 9. den Obstrukce proudění vzduchu a zánět dolních cest dýchacích také vyvrcholily 9. den. Maximální zatížení virem se objevilo 4. den při výplachu nosu a 5. den ve sputu. U přirozeně se vyskytujících exacerbací se pacienti objevují 3–4 dny po nástupu příznaků exacerbace7 a naše údaje ukazují, že vrchol replikace viru již pravděpodobně nastal v této době. Proto může být intervence antivirotiky v době exacerbace příliš pozdě. U 63 % subjektů s CHOPN v naší studii se rozvinuly bakteriální infekce po experimentální infekci rhinovirem. Zatímco virová zátěž dosáhla vrcholu v den 5, většina bakteriálních infekcí se objevila později ve dnech 12 a 15 po inokulaci, což naznačuje, že rinovirová infekce zvyšuje náchylnost k bakteriální infekci. Proto léčba virových infekcí může mít další výhodu snížení sekundárních bakteriálních infekcí.

Predikce rizika exacerbace: předběžná data z experimentálního modelu Data získaná z našeho experimentálního modelu nám umožnila vyhodnotit vztahy mezi markery v době počáteční URTI a měření následné závažnosti exacerbace. Vrchol příznaků horních cest dýchacích koreloval s vrcholem skóre dolních dýchacích cest (p=0,0037, r=0,58), počty zánětlivých buněk ve sputu (p=0,018, r=0,5) a zatížení virem sputa (p=0,014, r = 0,51). Pokles maximálního výdechového průtoku v den 5 koreloval s maximálním skóre dolního dýchání (p=0,023, r=-0,47), skóre dušnosti (p=0,0079, r=-0,54) a zatížení virem sputa (p=0,03, r=-0,45). Krevní neutrofily 5. den korelovaly s maximálním poklesem FEV1 (p=0,0072, r=-0,55), celkový počet leukocytů 5. den s maximálním poklesem FEV1/FVC (p=0,04, r=-0,43) a zátěž virem z nosní laváže v den 5 korelovala s maximálním poklesem FEV1 (p=0,0186, r=-0,49). Tyto údaje naznačují, že parametry, jako jsou symptomy, obstrukce dýchacích cest, počet periferních leukocytů a virová zátěž měřená během URTI u pacientů s CHOPN, korelují s následnými symptomy dolních dýchacích cest, obstrukcí dýchacích cest a zánětem dýchacích cest a mohly by předpovídat riziko exacerbace. Tato studie se však týkala malého počtu pacientů s mírnou až středně těžkou CHOPN a tato zjištění je třeba prozkoumat u větší kohorty pacientů s širším rozsahem závažnosti CHOPN s přirozeně se vyskytujícími infekcemi.

Biomarkery Exacerbace jsou definovány nárůstem symptomů a diagnóza závisí na subjektivním posouzení symptomů pacienty a poskytovateli zdravotní péče. Neexistují žádné markery – biologické ani fyziologické –, které by bylo možné použít k definování exacerbace. Exacerbace jsou spojeny se zánětem dýchacích cest, ale přímé měření zánětlivých markerů je obtížné, protože bronchoalveolární laváž a endobronchiální biopsie jsou příliš invazivní a kondenzace sputa a vydechovaného vzduchu je příliš složitá a časově náročná na to, aby byla praktická v běžné klinické praxi. Krev lze snadno získat pro měření biomarkerů, ale není prokázáno, že systémové markery odrážejí zánět dýchacích cest nebo korelují s klinickými výsledky u exacerbací CHOPN. Nosní vzorky se také snadno získávají a existují data ukazující, že nosní zánětlivé markery korelují se zánětem dolních cest dýchacích8 a my jsme uvedli, že IL-8 a IL-6 jsou zvýšené při výplachu nosu po experimentální infekci rhinovirem5. Řada biomarkerů byla zkoumána jak jako markery exacerbací CHOPN, tak jako indikátory specifické etiologie. Copeptin9 a sérový amyloid A (SAA)10 korelují s klinickými výsledky u exacerbací CHOPN, interferonem indukovaný protein-10 (IP-10)11 a neopterin byly identifikovány jako potenciální markery virových respiračních infekcí12,13 a prokalcitonin jako marker bakteriálních infekce 14. Žádný z těchto markerů však nebyl specificky zkoumán jako prediktor výsledků po URTI u CHOPN.

Vztah mezi virovými URTI a exacerbacemi CHOPN Údaje z naší studie naznačují, že léčba v době počáteční URTI může být nezbytná k prevenci virem vyvolaných exacerbací. Tato strategie však riskuje léčbu URTI, které neprogredují do exacerbace vedoucí k nadměrné léčbě. Pouze jedna studie zkoumala exacerbace po URTI u pacientů s CHOPN a zjistila, že 43 % URTI bylo následováno exacerbacemi15. V této studii však byly URTI identifikovány retrospektivně z karet příznakového deníku, a proto nebylo prokázáno, že příznaky byly způsobeny virovou infekcí. Až 75 % pacientů s CHOPN si stěžuje na symptomy horních cest dýchacích, když jsou klinicky stabilní16, takže symptomy horních cest dýchacích způsobené jinými faktory než virovými infekcemi by v této studii oslabily souvislost mezi URTI a exacerbacemi CHOPN. Skutečná asociace bude pravděpodobně vyšší a lze ji určit pouze virologickým potvrzením infekce. Také riziko exacerbace po virové URTI nemusí být u všech pacientů s CHOPN stejné, ale může být ovlivněno hostitelskými faktory, jako je FEV1, předchozí exacerbace v anamnéze a kouření. V současné době nejsou k dispozici žádné údaje o tom, jak tyto faktory mohou ovlivnit riziko exacerbace po virové URTI. Všechny dosavadní studie exacerbací CHOPN zahrnovaly pacienty, kteří se u nich projevili symptomy exacerbace. Proto byla promarněna příležitost zkoumat vztah mezi předchozí URTI a exacerbací. Cílem této studie je získat kohortu pacientů s CHOPN a vyšetřit je, když se u nich rozvine URTI, aby bylo možné prospektivně prozkoumat vztah s následnou exacerbací.

2) Studijní cíle

1. Stanovit podíl URTI s potvrzenou virovou etiologií u pacientů s CHOPN, které progredují do akutní exacerbace, a určit specifické virové etiologie.
2. Identifikovat klinické, virové a biologické markery, které předpovídají progresi URTI k exacerbaci a korelují se závažností exacerbace.
3. Stanovit základní klinické charakteristiky, které identifikují pacienty s vysokým rizikem rozvoje exacerbací po virové URTI.
4. Stanovit frekvenci a rizikové faktory bakteriální infekce po virové URTI u pacientů s CHOPN.
5. Vyvinout model kombinující základní charakteristiky pacientů, klinická měření a biomarkery, které budou predikovat riziko exacerbace po virové URTI u pacientů s CHOPN.

3) Metody Subjekty studie Kohorta 100 subjektů s CHOPN bude rekrutována z kliniky hrudníku a alergií v nemocnici St Mary's, Paddington, součást Imperial College Healthcare NHS Trust, a komunitních klinik v místních oblastech Westminster a Kensington a Chelsea.

Kritéria pro zařazení Hlavním kritériem pro zařazení jsou pacienti ve věku 40–85 let s diagnózou CHOPN potvrzenou spirometrií.

Kritéria vyloučení

• Účastníci, kteří mají potíže s porozuměním angličtině, takže nebudou schopni odpovídat na dotazníky týkající se symptomů.
• Účastníci, kteří mají jiný zdravotní stav, jako je pokročilá rakovina, což znamená, že mají očekávanou délku života méně než 2 roky, a tak by nebyli schopni dokončit sledování.
• Vyloučeni budou také účastníci, pro které by bylo obtížné docházet na časté návštěvy nemocnice.

Základní návštěva Po informovaném souhlasu účastníci absolvují základní návštěvu, při které budou mít podrobnou klinickou charakteristiku včetně dokumentace kuřáckého stavu, komorbidit, frekvence exacerbací a medikace a měření funkce plic (FEV1, FVC, FEV1,/FVC, PEF, převodní koeficient). Sputum, nosní tekutina a krev budou odebrány pro základní hodnocení bakteriální a virové kolonizace a měření zánětu dýchacích cest a biomarkerů. V průběhu studie budou mít účastníci opakované návštěvy se stejným hodnocením a odběrem vzorků každé 3 měsíce. Účelem je zdokumentovat jakékoli změny klinického stavu (např. změna kuřáckého stavu) a zajistit, že pokud dojde k nachlazení/exacerbaci, proběhne stabilní návštěva, se kterou se budou porovnávat parametry během posledních 3 měsíců.

Po základní návštěvě zahájí účastníci záznam symptomů dolních cest dýchacích pomocí nástroje Exacerbations of Chronic Pulmonary Disease Tool (EXACT), nového pacientem hlášeného deníku výsledků, který byl ověřen v kohortových studiích CHOPN17. Budou pokračovat ve své obvyklé medikaci a lékařské péči, ale bude jim doporučeno, aby kontaktovali vyšetřovatele, pokud se u nich objeví příznaky nachlazení nebo exacerbace. Každý týden budou telefonicky kontaktováni ve snaze identifikovat všechny epizody zvýšených respiračních příznaků.

Studená návštěva Subjektům bude doporučeno, aby hlásili zkoušejícím, pokud se u nich rozvinou příznaky URTI. Když k tomu dojde, budou viděni do 24 hodin pro „studenou návštěvu“ – podrobnosti o této návštěvě jsou uvedeny níže.

Symptomy URTI budou kvantifikovány pomocí dotazníku Wisconsin Upper Respiratory Symptom Survey (WURSS-21)18. WURSS-21 je hodnocení kvality života, které měří účinky běžného nachlazení související se zdravím a používá se k predikci exacerbací po URTI u astmatiků19. K získání skóre WURSS-21 u subjektů s CHOPN bez nachlazení bude podskupině stabilních subjektů podáván WURSS-21 po dobu 14 po sobě jdoucích dnů. Budou měřeny FEV1, FVC, FEV1,/FVC a PEF a odebrány vzorky nosní tekutiny, indukovaného sputa a krve.

Všichni jedinci budou viděni 7 dní po návštěvě za studena s opakovaným odběrem vzorků, pokud se u nich předtím nerozvine exacerbace. Vzhledem k tomu, že exacerbace jsou definovány symptomy a vnímání symptomů je subjektivní, účelem této návštěvy bude změření objektivních markerů, jako jsou funkce plic a zánětlivé markery v odebraných klinických vzorcích. Porovnání těchto údajů mezi účastníky, kteří exacerbace nehlásí, poskytne objektivnější důkaz, že kromě příznaků došlo k exacerbaci.

Návštěva při exacerbaci Když se u jedinců rozvine URTI, budou sledovány symptomy následné exacerbace, a pokud k ní dojde, čeká je další návštěva nazvaná „návštěva při exacerbaci“. Pokud u účastníků dojde k exacerbaci bez předchozího URTI, budou také vidět. Klinické hodnocení včetně fyzikálního vyšetření, skóre příznaků a spirometrie bude provedeno za účelem vyhodnocení závažnosti exacerbace a provede se stejné klinické vzorky jako při nachlazení. Subjekty budou mít další návštěvy 2 a 6 týdnů po začátku exacerbace s opakovaným hodnocením a klinickým odběrem vzorků.

Milníky Pacienti s CHOPN mají v průměru 1–2 nachlazení za rok, takže nábor skupiny 100 subjektů a jejich sledování po dobu 24 měsíců, aby zahrnovala 4 sezóny maximální aktivity rhinoviru, by mělo poskytnout alespoň 200 epizod URTI k vyhodnocení. Poté budeme potřebovat 6 měsíců na dokončení laboratorních analýz a analýzu dat.

4) Postupy studie Výtěr z krku Pro získání vzorků z hltanu pro detekci viru se použije sterilní suchý bavlněný tampon. To se provádí se subjektem sedícím. Zajistěte dostatečné osvětlení a v případě potřeby použijte jazykový depresor. Opatrně vyjměte tampon z nádobky, abyste se ujistili, že hrot není kontaminován, a otřete dorzální část hltanu a měkkého patra, vyhněte se jazyku. Vložte tampon do suché nádoby a před analýzou zmrazte na -80 °C a další do bakteriologického kultivačního média.

Nasorpce

Tekutina z nosní výstelky bude odebírána metodou syntetické absorpční matrice (SAM). Získají se objemy kapaliny 50-100μL a 50μL stačí k měření až 20 analytů pomocí platformy MSD (http://www.meso-scale.com), které jsme již použili k testování rozpustných mediátorů ve studiích na lidech a lze získat na zakázku vyrobené destičky pro měření vybraných mediátorů. Proužky SAM budou použity po dobu 2 minut v nosní dírce k získání opakovaných vzorků čistého nosního ELF. Jedná se o bezbolestný minimálně invazivní zákrok, který nevyžaduje žádné lokální anestetikum. Po odběru vzorků se SAM umístí do 1 ml zkumavky pro mikrocentrifugu obsahující 100 μl elučního pufru (PBS/1 % hovězí sérový albumin/1 % Triton®). Aby bylo možné určit objem tekutiny získané nasosorpcí, a tedy konečnou koncentraci rozpustných mediátorů v ELF, musí být známa hmotnost SAM před a po odběru vzorků. Je třeba dodržet následující postup:

• Zaznamenejte suchou hmotnost SAM (DS)
• Zaznamenejte suchou prázdnou hmotnost mikrozkumavky (DT)
• Zaznamenejte kombinovanou hmotnost mikrocentrifugační zkumavky obsahující SAM v elučním pufru (CW)
• Vypočítejte a zaznamenejte hmotnost ELF (mg):

Hmotnost ELF = CW - (DT + DS + 100) (100 mg je hmotnost 100 μL elučního pufru) SAM bude transportován na suchém ledu do laboratoře.

Výplach nosu

Nosní výplach se provádí pomocí následující techniky:

• Postup, který se má provést v podtlakové místnosti na ICRRU
• 5 ml 0,9% fyziologického roztoku se zavede do jedné nosní dírky pomocí injekční stříkačky, přičemž subjekt sedí s hlavou zakloněnou dozadu.
• Fyziologický roztok se ponechá v nose po dobu 5 sekund a poté se vyfoukne do sterilního hrnce. Postup se poté opakuje pro druhou nosní dírku.
• Tekutina se poté alikvotuje do sterilních mikrocentrifugačních zkumavek a odstředí pro analýzu buněk a supernatanty se zmrazí na -80 °C.

Nosní výplach bude analyzován pomocí PCR na respirační viry. Všechny vzorky, které jsou pozitivní na rinoviry, budou dále analyzovány pomocí kvantitativní PCR za účelem stanovení virové zátěže.

Odběr krve Krev bude odebrána při základní návštěvě pro separaci séra pro měření zánětlivých markerů a měření C-reaktivního proteinu a kompletního krevního obrazu. Ty budou zpracovány v laboratořích Respiratory Medicine v budově Medical School, St Mary's Campus.

Celkové množství krve odebrané při každé návštěvě by činilo 20 ml.

Indukované sputum Sputum bude indukováno a zpracováno pomocí standardních protokolů20. Stručně řečeno, účastníci budou premedikováni 200 mg salbutamolu pomocí inhalátoru s odměřenou dávkou a velkoobjemového spaceru a bude změřena výchozí hodnota FEV1. 3% fyziologický roztok se podá ultrazvukovým nebulizérem DeVilbiss UltraNeb99 v intervalech 2 minut a znovu se změří FEV1. Pokud FEV1 klesne o 20 %, výkon bude přerušen a bude podáván další salbutamol. Jinak bude postup pokračovat a FEV1 se bude měřit každé 2 minuty, dokud se nezíská adekvátní vzorek sputa. Sputum bude zpracováno do 2 hodin po indukci. Sputové zátky budou vybrány ze slin makroskopickou kontrolou vzorku a alikvotní část se vybere a nezpracovaná skladuje při -80oC pro qRT-PCR pro detekci viru. Alikvotní část sputa bude také uchována pro detekci bakterií. Zbývající vzorek se zváží, přidá se 0,1% dithiothreitol (DTT) v poměru 4 ml DTT k 1 g sputa a směs se míchá a filtruje. Přidá se stejný objem PBS, filtrát se odstředí a supernatant se rozdělí na alikvoty a uloží se při -80 °C. Buněčná peleta se promyje a resuspenduje a buňky se spočítají, aby se získal celkový počet buněk. Cytospiny budou připraveny a obarveny pomocí soupravy Shandon Diffquick kit (Thermo Shandon Ltd, Cheshire, UK), kódovány a spočítány slepě podle stavu studie, aby se získal rozdílný počet buněk. Počty buněk budou vyjádřeny jako procento alespoň 400 zánětlivých buněk.

5) Regulační otázky Etické schválení Pro tuto studii bylo získáno schválení Etické komise pro výzkum ve východním Londýně. Studie bude předložena k Site Specific Assessment (SSA) v Imperial College Healthcare NHS Trust. Před přijetím účastníků do studie bude hlavní řešitel vyžadovat kopii schvalovacího dopisu pro výzkum a vývoj. Studie bude provedena v souladu s doporučeními pro lékaře zapojené do výzkumu na lidských subjektech přijatými 18. světovým lékařským shromážděním, Helsinskou deklarací z roku 1964 a pozdějšími revizemi.

Souhlas Souhlas se vstupem do studie bude požadován od každého účastníka pouze po úplném vysvětlení, nabídnutí informačního letáku, času na zvážení a případných dotazech, na které účastníci odpověděli. Bude získán podepsaný souhlas účastníka. Musí být respektováno právo účastníka odmítnout účast bez udání důvodů. Poté, co účastník vstoupí do studie, má lékař možnost v jakékoli fázi poskytnout alternativní léčbu k léčbě uvedené v protokolu, pokud se domnívá, že je to v nejlepším zájmu účastníka, ale důvody, proč tak činí, by měly být zaznamenány. V těchto případech účastníci zůstávají ve studii pro účely sledování a analýzy dat. Všichni účastníci mohou kdykoli odstoupit od protokolární léčby bez udání důvodů a bez újmy na další léčbě.

Důvěrnost Hlavní řešitel a celý výzkumný tým zachovají důvěrnost účastníků účastnících se studie a budou se řídit zákonem o ochraně osobních údajů.

Odškodnění Imperial College v Londýně jako sponzor této studie má pojištění škod z nedbalosti a bez nedbalosti, které se na tuto studii vztahují. Ty byly uspořádány prostřednictvím Společného výzkumného úřadu.

Sponzor Imperial College London bude vystupovat jako hlavní sponzor této studie. Delegované odpovědnosti budou přiděleny trustu NHS, který se této studie účastní.

Financování Po úspěšné žádosti do Biomedical Research Center (BRC) Imperial Healthcare NHS Trust a Imperial College financuje BRC tuto studii. Vyšetřovatelé nedostanou žádné další platby nad jejich běžné platy. Účastníkům studie budou proplaceny cestovní náklady.

Audity a inspekce Studie může podléhat inspekci a auditu ze strany Imperial College London v rámci jejich pravomoci sponzora a dalších regulačních orgánů, aby bylo zajištěno dodržování GCP a Rámce řízení výzkumu NHS pro zdravotnictví a sociální péči (2. vydání).

Řízení studie Každodenní řízení studie bude koordinovat Dr. Patrick Mallia, hlavní řešitel projektu.

Publikační politika Očekáváme, že po analýze budou data z této studie široce distribuována v lékařské a vědecké komunitě. Doufáme, že díky prezentacím na místních, národních a mezinárodních setkáních budeme široce publikovat v lékařské literatuře. Kromě toho máme vynikající mediální oddělení na Imperial College a zveřejňujeme výzkum, který má veřejný zájem, když je publikován. Žádné identifikační údaje o účastnících nebudou zveřejněny.

6) Definice nežádoucích příhod Nežádoucí příhoda (AE): jakákoliv nežádoucí lékařská událost u pacienta nebo subjektu klinické studie.

Závažná nežádoucí příhoda (SAE): jakýkoli nežádoucí a neočekávaný zdravotní výskyt nebo účinek, který:

• Výsledkem je smrt
• Je život ohrožující – označuje událost, při které byl subjekt v době události ohrožen smrtí; nevztahuje se na událost, která by hypoteticky mohla způsobit smrt, kdyby byla vážnější
• Vyžaduje hospitalizaci
• Výsledkem je přetrvávající nebo významná invalidita nebo neschopnost
• Je vrozená anomálie nebo vrozená vada

Postupy hlášení Všechny nežádoucí příhody by měly být hlášeny. V závislosti na povaze události by měly být dodrženy níže uvedené postupy hlášení. Jakékoli dotazy týkající se hlášení nežádoucích účinků by měly být v první řadě směrovány na hlavního zkoušejícího.

Nezávažné AE Všechny takové události, ať již očekávané nebo neočekávané, by měly být zaznamenány.

Závažné AE Formulář SAE by měl být vyplněn a odeslán faxem hlavnímu zkoušejícímu a sponzorovi do 24 hodin.

Všechny SAE by měly být hlášeny Etickému výboru pro výzkum ve východním Londýně, kde podle názoru hlavního řešitele událost byla:

• 'příbuzný', tj. vyplývající z administrace některého z výzkumných postupů; a
• 'neočekávané', tj. událost, která není uvedena v protokolu jako očekávaná událost

Hlášení souvisejících a neočekávaných SAE by měla být předložena etickému oddělení, sponzorovi a kanceláři výzkumu a vývoje do 15 dnů poté, co se hlavní zkoušející o události dozvěděl, pomocí formuláře NRES SAE pro studie, které nejsou IMP.

Kontaktní údaje pro hlášení SAE Fax: 020 7262 8913 k rukám Dr. Patricka Mallia Tel: 020 7594 3751 (Po až Pá 09:00 - 17:00)

7) Záznamy Naše skupina má zavedené záznamy vysoce kvalitního výzkumu v oblasti virových infekcí u astmatu a CHOPN. Zavedli jsme protokoly pro PCR detekci respiračních virů, kvantitativní PCR pro rhinoviry a spolupracovali jsme s Imperial College Healthcare NHS Trust Microbiology Laboratory na semikvantitativních bakteriálních kulturách. Zavedli jsme protokoly a zkušenosti s měřením zánětlivých mediátorů v supernatantech nosní tekutiny a sputa a rozvíjíme odborné znalosti v používání platformy MSD. Dr. Elkin má zkušenosti s náborem kohort pacientů s CHOPN pro dlouhodobé klinické studie.

8) Očekávaný dopad Tato studie bude první, která určí vztah mezi virovou URTI a exacerbacemi u pacientů s CHOPN. Stanoví klinické faktory a biomarkery, které předpovídají riziko exacerbace po URTI. Získaná data budou enormně zajímavá pro farmaceutický průmysl a klinické výzkumníky, protože otevřou cestu pro testování antivirových terapií virem vyvolaných exacerbací CHOPN.