Genetická identifikace onemocnění

Navrhuje se identifikovat a rekrutovat jednotlivce a/nebo rodiny se specifikovanými poruchami uvedenými výše. Všem dospělým subjektům bude odebráno 10-20 ml (2-4 čajové lžičky) periferní krve. Menší objemy krve by se odebíraly dětem na základě jejich věku/velikosti. V některých případech se jako adekvátní alternativa k odběru periferní krve odeberou bukální buňky pomocí výtěrů z tváří (Epicentre Biotechnologies). Všichni relevantní žijící členové každého rodokmenu budou požádáni o bezplatnou účast pouze na základě výzkumu. Genomová DNA bude extrahována standardními metodami a použita jako templát pro amplifikační reakce polymerázové řetězové reakce (PCR). Jednotlivci budou genotypováni na markerech a sekvenován kandidátský gen.

V zásadě budou použity dva přístupy:

1. Okolnosti, které mohou poskytnout znalost kandidátních genů, zahrnují přehledy literatury, biologii onemocnění, pochopení biologických drah, chromozomální přestavby, mutanty v modelových organismech atd. Pokud existují kandidátní geny, navrhuje se použít na DNA z rodin propojené páry mikrosatelitů a/nebo jednonukleotidový polymorfismus (SNP) PCR primerů, aby se určilo, zda existuje ko-segregace onemocnění a markerů, a tedy spojení mezi genem onemocnění a dříve mapované značky.

   Pokud se zdá, že onemocnění je spojeno s kandidátním genem, použijí se PCR primery lemující všechny kódující exony k amplifikaci exonů a hranic intron/exon s následným sekvenováním k detekci mutací způsobujících onemocnění. K dispozici je webová stránka, která umožňuje návrh primerů pro amplifikaci exonů kandidátských genů (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway ). Pokud existuje velmi silný kandidátní gen, bude provedeno sekvenování kandidátního genu na postižených jednotlivých vzorcích bez předchozího provedení vazebné studie.

2. Když neexistují žádné zjevné kandidátní geny a byla shromážděna rodina dostatečné velikosti, navrhuje se použít mikročipy Affymetrix SNP k provedení hledání vazby v celém lidském genomu. Tento přístup jsme již dříve úspěšně použili (Shrimpton et al 2004) s využitím analýzy vazby celého genomu pomocí Human Mapping 10K Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Pole 10K umožňuje současné genotypování více než 11 200 mapovaných SNP rozmístěných po celém lidském genomu v intervalech 210 kB. K dispozici jsou také pole Affymetrix 100K a 500K. Informace o genotypu SNP budou analyzovány pomocí softwaru Varia (Silicon Genetics) a/nebo Merlin. Data budou použita k definování kritické oblasti. Pokud je detekována statisticky významná segregace, kandidátské geny v kritické oblasti budou vyhodnoceny a seřazeny podle pravděpodobnosti, že se jedná o gen onemocnění. Kandidátské geny budou poté sekvenovány, jak je podrobně popsáno výše.

Souhrn.

1. Identifikujte kandidátské geny onemocnění z vazebných studií, silných nepřímých důkazů nebo vodítek z fenotypu.
2. Sekvenujte kandidátní geny pro detekci mutací způsobujících onemocnění.
3. Vyhodnocení zjištěné odchylky.