Identificazione del gene della malattia genetica

Si propone di identificare e reclutare individui e/o famiglie con specificati i disturbi sopra elencati. Verranno raccolti 10-20 ml (2-4 cucchiaini) di sangue periferico da tutti i soggetti adulti. Volumi minori di sangue verrebbero raccolti dai bambini in base alla loro età/taglia. In alcuni casi, come alternativa adeguata alla raccolta del sangue periferico, le cellule buccali saranno raccolte utilizzando tamponi guanciali (Epicentre Biotechnologies). A tutti i membri viventi rilevanti di ciascun pedigree verrà chiesto di partecipare, gratuitamente, solo a scopo di ricerca. Il DNA genomico sarà estratto con metodi standard e utilizzato come templato per le reazioni di amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR). Gli individui saranno genotipizzati in corrispondenza dei marcatori e il gene candidato sarà sequenziato.

Verranno utilizzati essenzialmente due approcci:

1. Le circostanze che possono fornire la conoscenza dei geni candidati includono revisioni della letteratura, biologia della malattia, comprensione dei percorsi biologici, riarrangiamenti cromosomici, mutanti negli organismi modello ecc. Quando esistono geni candidati, si propone di utilizzare coppie di primer PCR di microsatelliti collegati e/o polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) sul DNA delle famiglie per determinare se esiste co-segregazione della malattia e dei marcatori e quindi collegamento tra il gene della malattia e marker precedentemente mappati.

   Se la malattia sembra essere collegata al gene candidato, i primer PCR che fiancheggiano tutti gli esoni codificanti verranno utilizzati per amplificare gli esoni ei confini introne/esone seguiti dal sequenziamento per rilevare le mutazioni che causano la malattia. È disponibile un sito Web che consente la progettazione di primer per amplificare gli esoni del gene candidato (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway ). Se esiste un gene candidato molto forte, il sequenziamento del gene candidato verrà eseguito sui singoli campioni interessati senza prima eseguire uno studio di collegamento.

2. Quando non esistono geni candidati evidenti ed è stata raccolta una famiglia di dimensioni sufficienti, si propone di utilizzare i microarray Affymetrix SNP per eseguire una ricerca di collegamento a livello di genoma umano. Abbiamo utilizzato questo approccio con successo in precedenza (Shrimpton et al 2004), utilizzando l'analisi del linkage dell'intero genoma con Human Mapping 10K Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). L'array 10K consente la genotipizzazione simultanea di oltre 11.200 SNP mappati distribuiti in tutto il genoma umano a intervalli di 210 KB. Sono disponibili anche gli array Affymetrix 100K e 500K. Le informazioni sul genotipo SNP saranno analizzate utilizzando il software Varia (Silicon Genetics) e/o Merlin. I dati verranno utilizzati per definire una regione critica. Se viene rilevata una segregazione statisticamente significativa, i geni candidati all'interno della regione critica saranno valutati e classificati in ordine di probabilità di essere il gene della malattia. I geni candidati verranno quindi sequenziati come descritto sopra.

Riepilogo.

1. Identifica i geni della malattia candidati da studi di linkage, forti prove circostanziali o indizi dal fenotipo.
2. Sequenza di geni candidati per rilevare mutazioni che causano malattie.
3. Valutazione della variazione rilevata.