Genetisk sjukdomsgenidentifiering

Det föreslås att identifiera och rekrytera individer och/eller familjer med specificerade sjukdomar som anges ovan. 10-20 ml (2-4 teskedar) perifert blod kommer att samlas in från alla vuxna försökspersoner. Mindre volymer blod skulle samlas in från barn baserat på deras ålder/storlek. I vissa fall, som ett adekvat alternativ till insamling av perifert blod, kommer buckala celler att samlas in med hjälp av kindpinnar (Epicentre Biotechnologies). Alla relevanta levande medlemmar av varje stamtavla kommer att uppmanas att delta, kostnadsfritt, endast på forskningsbasis. Genomiskt DNA kommer att extraheras med standardmetoder och användas som mall för Polymerase Chain Reaction (PCR) amplifieringsreaktioner. Individer kommer att genotypas vid markörer och kandidatgensekvenseras.

I huvudsak kommer två tillvägagångssätt att användas:

1. Omständigheter som kan ge kunskap om kandidatgener inkluderar genomgångar av litteraturen, sjukdomens biologi, förståelse av biologiska vägar, kromosomförändringar, mutanter i modellorganismer etc. När kandidatgener existerar föreslås det att man använder länkade mikrosatellit- och/eller enkelnukleotidpolymorfism (SNP) PCR-primerpar på DNA från familjer för att avgöra om det finns samsegregering av sjukdomen och markörer och därmed koppling mellan sjukdomsgenen och tidigare kartlagda markörer.

   Om sjukdomen verkar vara kopplad till kandidatgenen kommer PCR-primrar som flankerar alla kodande exoner att användas för att amplifiera exonerna och intron/exongränserna följt av sekvensering för att detektera sjukdomsorsakande mutationer. En webbplats som möjliggör design av primrar för att amplifiera kandidatgenexoner är tillgänglig (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway ). Om en mycket stark kandidatgen existerar, kommer kandidatgensekvensering att utföras på påverkade individuella prover utan att först utföra en länkstudie.

2. När inga uppenbara kandidatgener existerar och en familj av tillräcklig storlek har samlats in, föreslås det att man använder Affymetrix SNP-mikroarrayer för att utföra en mänsklig genomomfattande sökning efter koppling. Vi har använt detta tillvägagångssätt med framgång tidigare (Shrimpton et al 2004), med hjälp av hela genomkopplingsanalysen med Human Mapping 10K Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). 10K Array tillåter samtidig genotypning av mer än 11 ​​200 kartlagda SNP: er fördelade över hela det mänskliga genomet med 210 KB intervaller. Affymetrix 100K och 500K arrayer är också tillgängliga. SNP genotypinformation kommer att analyseras med hjälp av Varia (Silicon Genetics) och/eller Merlin programvara. Data kommer att användas för att definiera en kritisk region. Om statistiskt signifikant segregation upptäcks, kommer kandidatgener inom den kritiska regionen att utvärderas och rangordnas i ordning efter deras sannolikhet att vara sjukdomsgenen. Kandidatgener kommer sedan att sekvenseras enligt ovan.

Sammanfattning.

1. Identifiera kandidatsjukdomsgener från länkstudier, starka indicier eller ledtrådar från fenotypen.
2. Sekvens kandidatgener för att upptäcka sjukdomsalstrande mutationer.
3. Utvärdering av upptäckt variation.