Identificação de genes de doenças genéticas

Propõe-se identificar e recrutar indivíduos e/ou famílias com os transtornos listados acima. 10-20 ml (2-4 colheres de chá) de sangue periférico serão coletados de todos os indivíduos adultos. Volumes menores de sangue seriam coletados de crianças com base em sua idade/tamanho. Em alguns casos, como uma alternativa adequada à coleta de sangue periférico, as células bucais serão coletadas com swabs de bochecha (Epicentre Biotechnologies). Todos os membros vivos relevantes de cada linhagem serão convidados a participar, gratuitamente, apenas com base em pesquisa. O DNA genômico será extraído por métodos padrão e utilizado como molde para reações de amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os indivíduos serão genotipados em marcadores e sequenciados os genes candidatos.

Serão usadas basicamente duas abordagens:

1. Circunstâncias que podem fornecer conhecimento de genes candidatos incluem revisões da literatura, biologia da doença, compreensão de vias biológicas, rearranjos cromossômicos, mutantes em organismos modelo, etc. Quando existem genes candidatos, propõe-se o uso de pares de primers de PCR de microssatélites ligados e/ou polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) no DNA das famílias para determinar se há co-segregação da doença e marcadores e, portanto, ligação entre o gene da doença e marcadores previamente mapeados.

   Se a doença parece estar ligada ao gene candidato, iniciadores de PCR que flanqueiam todos os éxons codificantes serão usados ​​para amplificar os éxons e os limites de íntron/exão seguidos de sequenciamento para detectar mutações causadoras de doenças. Um site que permite o projeto de primers para amplificar éxons de genes candidatos está disponível (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway ). Se existir um gene candidato muito forte, o sequenciamento do gene candidato será realizado em amostras individuais afetadas sem primeiro realizar um estudo de ligação.

2. Quando não existem genes candidatos óbvios e uma família de tamanho suficiente foi coletada, propõe-se o uso de microarrays Affymetrix SNP para realizar uma pesquisa de ligação em todo o genoma humano. Nós usamos essa abordagem com sucesso antes (Shrimpton et al 2004), utilizando toda a análise de ligação do genoma com o Human Mapping 10K Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). O 10K Array permite a genotipagem simultânea de mais de 11.200 SNPs mapeados espaçados por todo o genoma humano em intervalos de 210 KB. As matrizes Affymetrix 100K e 500K também estão disponíveis. As informações do genótipo SNP serão analisadas usando o software Varia (Silicon Genetics) e/ou Merlin. Os dados serão usados ​​para definir uma região crítica. Se segregação estatisticamente significativa for detectada, os genes candidatos dentro da região crítica serão avaliados e classificados em ordem de probabilidade de serem o gene da doença. Os genes candidatos serão então sequenciados conforme detalhado acima.

Resumo.

1. Identifique genes candidatos a doenças a partir de estudos de ligação, fortes evidências circunstanciais ou pistas do fenótipo.
2. Sequenciar genes candidatos para detectar mutações causadoras de doenças.
3. Avaliação da variação detectada.