Genetikai betegség génazonosítása

Javasoljuk a fent felsorolt ​​rendellenességekkel küzdő egyének és/vagy családok azonosítását és toborzását. Minden felnőtt alanytól 10-20 ml (2-4 teáskanál) perifériás vért vesznek. Kisebb mennyiségű vért gyűjtenek a gyermekektől életkoruk/méretük alapján. Egyes esetekben a perifériás vér gyűjtésének megfelelő alternatívájaként a szájüregi sejteket arctamponnal gyűjtik (Epicentre Biotechnologies). Az egyes törzskönyvek minden érintett élő tagját felkérik, hogy ingyenesen vegyen részt, kizárólag kutatási alapon. A genomi DNS-t standard módszerekkel extraháljuk, és templátként használják fel polimeráz láncreakciós (PCR) amplifikációs reakciókhoz. Az egyedeket a markereknél genotipizálják, és a jelölt géneket szekvenálják.

Lényegében két megközelítést alkalmaznak:

1. A jelölt génekről ismereteket nyújtó körülmények közé tartozik az irodalom áttekintése, a betegség biológiája, a biológiai utak megértése, a kromoszóma-átrendeződések, a modellszervezetek mutánsai stb. Ha léteznek jelölt gének, javasolt kapcsolt mikroszatellit és/vagy egy nukleotid polimorfizmus (SNP) PCR primer párok használata a családokból származó DNS-en annak meghatározására, hogy a betegség és a markerek együtt szegregálódnak-e, és így kapcsolat van-e a betegség génje és korábban feltérképezett markerek.

   Ha úgy tűnik, hogy a betegség a jelölt génhez kapcsolódik, az összes kódoló exont szegélyező PCR primereket használnak az exonok és az intron/exon határok amplifikálására, majd a szekvenálást a betegséget okozó mutációk kimutatására. Elérhető egy weboldal, amely lehetővé teszi primerek tervezését a jelölt génexonok amplifikálására (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway ). Ha létezik egy nagyon erős jelölt gén, akkor a jelölt gén szekvenálását az érintett egyedi mintákon anélkül végzik el, hogy először kapcsolódási vizsgálatot végeznének.

2. Ha nem léteznek nyilvánvaló jelölt gének, és megfelelő méretű családot gyűjtöttek össze, javasolt az Affymetrix SNP mikrotömbök használata az emberi genomra kiterjedő kapcsolódási keresés elvégzésére. Ezt a megközelítést már korábban is sikeresen alkalmaztuk (Shrimpton és mtsai, 2004), a Human Mapping 10K Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) segítségével a teljes genom kapcsolódási elemzést felhasználva. A 10K Array lehetővé teszi több mint 11 200 feltérképezett SNP egyidejű genotipizálását az emberi genomban 210 KB-os időközönként. Affymetrix 100K és 500K tömbök is kaphatók. Az SNP genotípus információit Varia (Silicon Genetics) és/vagy Merlin szoftverrel elemezzük. Az adatok egy kritikus régió meghatározására szolgálnak. Ha statisztikailag szignifikáns szegregációt észlelünk, akkor a kritikus régión belüli jelölt géneket értékeljük és rangsoroljuk aszerint, hogy a betegség génje legyen. A jelölt géneket ezután a fent részletezett módon szekvenálják.

Összegzés.

1. Azonosítsa a jelölt betegséggéneket kapcsolódási vizsgálatokból, erős közvetett bizonyítékokból vagy a fenotípusból származó nyomokból.
2. Sorolja fel a jelölt géneket a betegséget okozó mutációk kimutatására.
3. Az észlelt eltérések értékelése.