Identification des gènes des maladies génétiques

Il est proposé d'identifier et de recruter des individus et/ou des familles présentant les troubles précisés ci-dessus. 10 à 20 ml (2 à 4 cuillères à café) de sang périphérique seront prélevés sur tous les sujets adultes. De plus petits volumes de sang seraient prélevés sur les enfants en fonction de leur âge/taille. Dans certains cas, comme alternative adéquate au prélèvement de sang périphérique, les cellules buccales seront prélevées à l'aide de frottis buccaux (Epicentre Biotechnologies). Tous les membres vivants concernés de chaque pedigree seront invités à participer, gratuitement, sur une base de recherche uniquement. L'ADN génomique sera extrait par des méthodes standard et utilisé comme matrice pour les réactions d'amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Les individus seront génotypés au niveau des marqueurs et le gène candidat séquencé.

Deux approches seront essentiellement utilisées :

1. Les circonstances qui peuvent fournir des connaissances sur les gènes candidats comprennent les revues de la littérature, la biologie de la maladie, la compréhension des voies biologiques, les réarrangements chromosomiques, les mutants dans les organismes modèles, etc. Lorsque des gènes candidats existent, il est proposé d'utiliser des paires d'amorces PCR microsatellites liées et/ou à polymorphisme nucléotidique unique (SNP) sur l'ADN des familles pour déterminer s'il existe une co-ségrégation de la maladie et des marqueurs et donc une liaison entre le gène de la maladie et marqueurs précédemment cartographiés.

   Si la maladie semble être liée au gène candidat, des amorces PCR flanquant tous les exons codants seront utilisées pour amplifier les exons et les limites intron/exon, suivies d'un séquençage pour détecter les mutations responsables de la maladie. Un site Web qui permet la conception d'amorces pour amplifier les exons de gènes candidats est disponible (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway ). Si un gène candidat très puissant existe, le séquençage du gène candidat sera effectué sur les échantillons individuels affectés sans effectuer au préalable une étude de liaison.

2. Lorsqu'aucun gène candidat évident n'existe et qu'une famille de taille suffisante a été collectée, il est proposé d'utiliser les microréseaux SNP Affymetrix pour effectuer une recherche de liaison à l'échelle du génome humain. Nous avons déjà utilisé cette approche avec succès (Shrimpton et al 2004), en utilisant l'analyse de liaison du génome entier avec le Human Mapping 10K Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Le 10K Array permet le génotypage simultané de plus de 11 200 SNP cartographiés espacés dans le génome humain à des intervalles de 210 KB. Des baies Affymetrix 100K et 500K sont également disponibles. Les informations sur le génotype des SNP seront analysées à l'aide des logiciels Varia (Silicon Genetics) et/ou Merlin. Les données seront utilisées pour définir une région critique. Si une ségrégation statistiquement significative est détectée, les gènes candidats dans la région critique seront évalués et classés par ordre de probabilité d'être le gène de la maladie. Les gènes candidats seront ensuite séquencés comme détaillé ci-dessus.

Résumé.

1. Identifiez les gènes candidats de la maladie à partir d'études de liaison, de preuves circonstancielles solides ou d'indices du phénotype.
2. Séquencer les gènes candidats pour détecter les mutations pathogènes.
3. Évaluation de la variation détectée.