Identyfikacja genów chorób genetycznych

Proponuje się identyfikację i rekrutację osób i/lub rodzin z określonymi zaburzeniami wymienionymi powyżej. Od wszystkich dorosłych osobników zostanie pobrane 10-20 ml (2-4 łyżeczki) krwi obwodowej. Mniejsze objętości krwi byłyby pobierane od dzieci w zależności od ich wieku/rozmiaru. W niektórych przypadkach, jako odpowiednia alternatywa dla pobierania krwi obwodowej, komórki policzkowe będą pobierane za pomocą wymazów z policzków (Epicentre Biotechnologies). Wszyscy żyjący przedstawiciele każdego rodowodu zostaną poproszeni o udział bezpłatny, wyłącznie w celach badawczych. Genomowy DNA zostanie wyekstrahowany standardowymi metodami i użyty jako matryca do reakcji amplifikacji łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Osoby zostaną poddane genotypowaniu na markerach i zsekwencjonowaniu genów kandydujących.

Zasadniczo zastosowane zostaną dwa podejścia:

1. Okoliczności, które mogą dostarczyć wiedzy na temat genów kandydujących, obejmują przegląd literatury, biologię choroby, zrozumienie szlaków biologicznych, rearanżacje chromosomalne, mutanty w organizmach modelowych itp. Jeśli istnieją geny kandydujące, proponuje się użycie par starterów do PCR połączonych mikrosatelitarnych i/lub polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) na DNA z rodzin w celu określenia, czy występuje współsegregacja choroby i markerów, a tym samym powiązanie między genem choroby a zaznaczone wcześniej znaczniki.

   Jeśli wydaje się, że choroba jest powiązana z genem kandydującym, startery PCR flankujące wszystkie eksony kodujące zostaną użyte do amplifikacji eksonów i granic intron/ekson, a następnie sekwencjonowanie w celu wykrycia mutacji powodujących chorobę. Dostępna jest strona internetowa, która umożliwia projektowanie starterów do amplifikacji eksonów genów kandydujących (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway ). Jeśli istnieje bardzo silny gen kandydujący, sekwencjonowanie genu kandydującego zostanie przeprowadzone na dotkniętych nim pojedynczych próbkach bez uprzedniego przeprowadzenia badania powiązań.

2. Gdy nie istnieją żadne oczywiste geny kandydujące i zebrano rodzinę o wystarczającej wielkości, proponuje się użycie mikromacierzy Affymetrix SNP do przeprowadzenia wyszukiwania powiązań w całym ludzkim genomie. Stosowaliśmy to podejście z powodzeniem wcześniej (Shrimpton i in. 2004), wykorzystując analizę powiązań całego genomu z Human Mapping 10K Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Macierz 10K umożliwia jednoczesne genotypowanie ponad 11 200 zmapowanych SNP rozmieszczonych w całym ludzkim genomie w odstępach 210 KB. Dostępne są również macierze Affymetrix 100K i 500K. Informacje o genotypie SNP będą analizowane przy użyciu oprogramowania Varia (Silicon Genetics) i/lub Merlin. Dane zostaną wykorzystane do zdefiniowania regionu krytycznego. Jeśli zostanie wykryta statystycznie istotna segregacja, geny kandydujące w regionie krytycznym zostaną ocenione i uszeregowane według prawdopodobieństwa bycia genem chorobowym. Geny kandydujące zostaną następnie zsekwencjonowane, jak wyszczególniono powyżej.

Streszczenie.

1. Zidentyfikuj potencjalne geny chorobowe na podstawie badań powiązań, mocnych poszlak lub wskazówek z fenotypu.
2. Sekwencja genów kandydujących w celu wykrycia mutacji powodujących choroby.
3. Ocena wykrytej zmienności.