Genidentifikasjon av genetisk sykdom

Det foreslås å identifisere og rekruttere individer og/eller familier med spesifiserte lidelser oppført ovenfor. 10-20 ml (2-4 teskjeer) perifert blod vil bli samlet inn fra alle voksne forsøkspersoner. Mindre mengder blod vil bli samlet inn fra barn basert på deres alder/størrelse. I noen tilfeller, som et adekvat alternativ til innsamling av perifert blod, vil bukkalceller samles inn ved hjelp av kinnprøver (Epicentre Biotechnologies). Alle relevante levende medlemmer av hver stamtavle vil bli bedt om å delta, gratis, kun på forskningsbasis. Genomisk DNA vil bli ekstrahert ved standardmetoder og brukt som mal for Polymerase Chain Reaction (PCR) amplifikasjonsreaksjoner. Individer vil bli genotypet ved markører og kandidatgen sekvensert.

I hovedsak vil to tilnærminger bli brukt:

1. Omstendigheter som kan gi kunnskap om kandidatgener inkluderer gjennomganger av litteraturen, sykdommens biologi, forståelse av biologiske veier, kromosomale omorganiseringer, mutanter i modellorganismer etc. Når kandidatgener eksisterer, foreslås det å bruke koblede mikrosatellitt- og/eller enkeltnukleotidpolymorfisme (SNP) PCR-primerpar på DNA fra familier for å bestemme om det er co-segregering av sykdommen og markører og dermed kobling mellom sykdomsgenet og tidligere kartlagte markører.

   Hvis sykdommen ser ut til å være knyttet til kandidatgenet, vil PCR-primere som flankerer alle kodende eksoner bli brukt for å amplifisere eksonene og intron/ekson-grensene etterfulgt av sekvensering for å oppdage sykdomsfremkallende mutasjoner. Et nettsted som muliggjør utforming av primere for å amplifisere kandidatgeneksoner er tilgjengelig (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway ). Hvis et veldig sterkt kandidatgen eksisterer, vil kandidatgensekvensering bli utført på berørte individuelle prøver uten først å utføre en koblingsstudie.

2. Når ingen åpenbare kandidatgener eksisterer, og en familie av tilstrekkelig størrelse er samlet, foreslås det å bruke Affymetrix SNP-mikroarrayer for å utføre et menneskelig genom-dekkende søk etter kobling. Vi har brukt denne tilnærmingen med hell før (Shrimpton et al 2004), ved å bruke hele genomkoblingsanalysen med Human Mapping 10K Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). 10K Array tillater samtidig genotyping av mer enn 11 200 kartlagte SNP-er fordelt på hele det menneskelige genomet med 210 KB-intervaller. Affymetrix 100K og 500K arrays er også tilgjengelige. SNP-genotypeinformasjon vil bli analysert ved hjelp av Varia (Silicon Genetics) og/eller Merlin-programvare. Dataene vil bli brukt til å definere en kritisk region. Hvis det oppdages statistisk signifikant segregering, vil kandidatgener innenfor den kritiske regionen bli evaluert og rangert i rekkefølge etter sannsynlighet for å være sykdomsgenet. Kandidatgener vil deretter bli sekvensert som beskrevet ovenfor.

Sammendrag.

1. Identifiser kandidatsykdomsgener fra koblingsstudier, sterke omstendigheter eller ledetråder fra fenotypen.
2. Sekvens kandidatgener for å oppdage sykdomsfremkallende mutasjoner.
3. Evaluering av påvist variasjon.