Genetisk sygdomsgenidentifikation

Det foreslås at identificere og rekruttere personer og/eller familier med specificerede lidelser anført ovenfor. 10-20 ml (2-4 teskefulde) perifert blod vil blive indsamlet fra alle voksne forsøgspersoner. Mindre mængder blod ville blive indsamlet fra børn baseret på deres alder/størrelse. I nogle tilfælde, som et passende alternativ til opsamling af perifert blod, vil bukkale celler blive opsamlet ved hjælp af kindpodninger (Epicentre Biotechnologies). Alle relevante levende medlemmer af hver stamtavle vil blive bedt om at deltage gratis, udelukkende på forskningsbasis. Genomisk DNA vil blive ekstraheret ved standardmetoder og brugt som skabelon for polymerasekædereaktion (PCR) amplifikationsreaktioner. Individer vil blive genotypet ved markører og kandidatgen sekventeret.

Grundlæggende vil to tilgange blive brugt:

1. Omstændigheder, der kan give viden om kandidatgener, omfatter gennemgange af litteraturen, sygdommens biologi, forståelse af biologiske veje, kromosomale omlejringer, mutanter i modelorganismer mv. Når der eksisterer kandidatgener, foreslås det at anvende koblede mikrosatellit- og/eller enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) PCR-primerpar på DNA'et fra familier for at bestemme, om der er co-segregering af sygdommen og markører og dermed kobling mellem sygdomsgenet og tidligere kortlagte markører.

   Hvis sygdommen ser ud til at være forbundet med kandidatgenet, vil PCR-primere, der flankerer alle kodende exoner, blive brugt til at amplificere exonerne og intron/exon-grænserne efterfulgt af sekventering for at påvise sygdomsfremkaldende mutationer. Et websted, der muliggør design af primere til at amplificere kandidatgen-exoner, er tilgængeligt (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway ). Hvis der eksisterer et meget stærkt kandidatgen, vil kandidatgensekventering blive udført på berørte individuelle prøver uden først at udføre en koblingsundersøgelse.

2. Når der ikke eksisterer nogen åbenlyse kandidatgener, og en familie af tilstrækkelig størrelse er blevet indsamlet, foreslås det at bruge Affymetrix SNP-mikroarrays til at udføre en human genom-dækkende søgning efter kobling. Vi har brugt denne tilgang med succes før (Shrimpton et al 2004) ved at bruge hele genomforbindelsesanalysen med Human Mapping 10K Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). 10K-arrayet tillader samtidig genotypning af mere end 11.200 kortlagte SNP'er fordelt på hele det humane genom med 210 KB-intervaller. Affymetrix 100K og 500K arrays er også tilgængelige. SNP genotype information vil blive analyseret ved hjælp af Varia (Silicon Genetics) og/eller Merlin software. Dataene vil blive brugt til at definere en kritisk region. Hvis der påvises statistisk signifikant segregation, vil kandidatgener inden for den kritiske region blive evalueret og rangeret i rækkefølge efter deres sandsynlighed for at være sygdomsgenet. Kandidatgener vil derefter blive sekventeret som beskrevet detaljeret ovenfor.

Resumé.

1. Identificer kandidatsygdomsgener fra koblingsundersøgelser, stærke indicier eller spor fra fænotypen.
2. Sekvens kandidatgener til at påvise sygdomsfremkaldende mutationer.
3. Evaluering af påvist variation.