Nanotechnologie pro detekci roztroušené sklerózy ve srovnání s autoimunitními a neurologickými onemocněními pomocí vydechovaných vzorků

RS je nejčastější chronické neurologické onemocnění postihující mladé dospělé, s nástupem obvykle ve věku 20-40 let. Ženy jsou postiženy 3-4krát častěji než muži. Jedná se o komplexní multifaktoriální onemocnění, jehož základem jsou jak genetické, tak environmentální faktory. Různé populace mají různou vnímavost (Compston a Coles 2008).

Onemocnění je charakterizováno 2 hlavními fenotypy: relabující-remitující nebo progresivní průběh. Klinické postižení je způsobeno destrukcí myelinu CNS (hlavně oligodendrocytů) v důsledku 3 procesů (Franklin 2002; Franklin a Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. Zánět – imunitní buňky s aberantní aktivitou napadají mozek a míchu a způsobují destrukci myelinu CNS (proces zvaný demyelinizace a sekundární neurodegenerace – ztráta axonů a neuronů)
2. Primární neurodegenerace (úbytek axonů a neuronů) – bez výrazného zánětu

3. Reparace - po zánětlivých a neurodegenerativních procesech následuje pokus CNS o reparaci - tato částečná a neúplná reparace je však často základem reziduálních deficitů a invalidity (Chandran, Hunt et al. 2008) .

   • Akutní relaps RS (prezentovaný jako paralýza, ztráta zraku atd.) – je považován za důsledek aberantní akutní imunitní aktivace a zánětlivého procesu v CNS.
   • Chronické kumulativní postižení – je považováno za důsledek neurodegenerativního procesu.

Reparační procesy jsou zaznamenány hlavně po akutním relapsu - a obnovení funkce může být spontánní. U těžkých relapsů je však někdy potřeba LÉČBA STEROIDY (Tischner a Reichardt 2007).

V návaznosti na lepší porozumění této nemoci byly v posledních 10-15 letech vyvinuty nové imunoterapie (COPAXON/; Interferon-beta) pro dlouhodobou léčbu. Ty však mohou nemoc zmírnit (snížit počet recidiv za rok), ale nevyléčit ji. Navíc jsou prospěšné pouze u ~ 40 % pacientů s recidivou - remisí. V současné době neexistuje žádná léčba pro pacienty s progresivní chorobou – kteří mají postupně narůstající invaliditu (Murray 2006).

V současné době nejsou k dispozici žádné biomarkery pro diagnostiku a rutinní sledování RS. Oligoklonální IgG v CSF – které pomáhají potvrdit diagnózu, vyžadují invazivní postup a nekorelují s aktivitou onemocnění ani odpovědí na terapii; a MRI, která umožňuje monitorování aktivity RS a odpověď na léčbu je příliš nákladná na rutinní použití (Link a Huang 2006; Murray 2006).

Dr Hossam Haick z Technionu vyvinul elektronický nos pro diagnostiku nemocí pomocí vzorků dechu. Předchozí studie doktora Haicka ukázaly, že elektronický nos založený na nanočásticích zlata by mohl tvořit základ levného a neinvazivního diagnostického nástroje pro rakovinu plic (Peng, Tisch et al. 2009) a onemocnění ledvin (Haick, Hakim et al. 2009 ).

Výzkumná hypotéza Biomarkery zánětu CNS a/nebo neurodegenerace a/nebo opravy CNS lze detekovat „elektronickým nosem“ ve vzorcích dechu osob s RS.

Cíle)

Identifikace biomarkerů:

1. Zánět CNS a autoimunita CNS
2. Neurodegenerace

3. Oprava CNS

   • které mohou sloužit jako markery pro: onemocnění (vs. kontroly), aktivitu onemocnění (předpovídání agresivního průběhu onemocnění, předpovídání relapsu; předpovídání maligní versus benigní RS); odpověď na terapii (steroidy, imunoterapie nebo neuroprotektivní látky).

Náčrt pracovního plánu:

Klinicky zhodnoťte několik skupin:

• Pacienti s RS v akutním relapsu před - vs - po 7, 30 a 90 dnech léčby steroidy - k posouzení indikátorů akutního zánětlivého procesu a účinků léčby steroidy.
• Pacienti s recidivující RS vs pacienti s progresivní RS vs. kontroly, které zahrnují zdravé jedince i pacienty trpící neurologickými a autoimunitními onemocněními jinými než RS – pro posouzení zánětlivých vs neurodegenerativních indikátorů.
• Pacienti s RS, kteří dobře reagují na imunoterapii nebo steroidy.

SBĚR DECHU:

Alveolární dech dobrovolníků se odebírá pomocí „offline“ metody, která účinně odděluje endogenní od exogenních těkavých biomarkerů dechu a vylučuje nosní stržení. Dva vaky po 750 ml vzorků dechu na dobrovolníka se odeberou do inertních vaků Mylar (Eco Medics, Duerten, Švýcarsko). Odběry par byly prováděny prodlouženým vzorkováním dechu do sběrného přístroje po dobu 15-20 minut s několika zastávkami během tohoto procesu. První tři minuty odběru dechu jsou vyřazeny z důvodu možné kontaminace vzduchu horních cest dýchacích. Následný hluboký vzduch je zadržen pro testovací účely. Vzorky se odebírají zkumavkou, která byla zavedena do úst dobrovolníka a připojena ke sběrnému vaku. Všichni účastníci poskytují podepsaný informovaný souhlas s touto studií, která se provádí po schválení a podle pokynů Helsinského výboru Carmel Medical Center a výboru Technion pro dohled nad experimenty na lidech.

CHEMICKÁ ANALÝZA VZORKŮ DECHU:

Pro chemickou analýzu vzorků dechu se používá plynová chromatografie/hmotnostní spektrometrie (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, Japonsko) v kombinaci se systémem tepelné desorpce (TD20; Shimadzu Corporation, Japonsko). K předběžné koncentraci VOC ve vzorcích dechu se používá adsorbční trubice Tenax® TA (Sigma Aldrich Ltd.). Pomocí na zakázku vyrobeného pumpového systému jsou vzorky dechu z Mylarových vaků nasávány přes TA zkumavku při průtoku 100 ml/min, poté jsou před analýzou přeneseny do zkumavky pro tepelnou desorpci (TD) (Sigma Aldrich Ltd.). pomocí GC-MS. Byl nastaven následující teplotní profil pece: (a) 10 minut při 35 °C; (b) náběh 4 °C/min do 150 °C; (c) 10 °C/min náběh až do 300 °C; a (d) 15 minut při 300 °C. Je použita kapilární kolona SLB-5ms (Sigma Aldrich Ltd.) s 5% fenylmethylsiloxanem (délka 30 m, vnitřní průměr 0,25 mm a tloušťka 0,5 um). Režim splitless vstřikování se používá po dobu 2 minut při konstantní lineární rychlosti 30 cm/s a průtoku kolonou 0,70 ml/min. Molekulární struktury VOC se určují pomocí standardní modulární sady s použitím 10 ppm isobutylenu (Calgaz, Cambridge, Maryland, USA) jako standardního kalibračního plynu během každého běhu. Analýza chromatogramu GC-MS je realizována pomocí programu pro analýzu po spuštění GCMS solutions verze 2.53SU1 (Shimadzu Corporation), využívající knihovnu sloučenin National Institute of Standards and Technology (NIST) (Gaithersburg, MD 20899-1070, USA).

SNÍMACÍ MĚŘENÍ:

Při interakci mezi vzorky dechu a detektorem se těkavé organické sloučeniny adsorbují do organické části snímaného materiálu Výsledek této adsorpce je převeden na elektrický signál (odpor), který je přenášen do makrosvěta (např. zařízení) přes (polo)vodivý materiál nacházející se ve stejném filmu. Výsledky jsou pak prezentovány na obrazovce počítače.

K provádění snímacích měření se používá automatizovaný systém řízený vlastním programem LabView (National Instruments). Senzory jsou testovány současně ve stejné expoziční komoře pomocí multifunkčního spínače Agilent 34980A. Pro napájení signálu střídavého napětí (0,2 V při 1 kHz) a pro měření odpovídajícího proudu (<10μA u studovaných zařízení) je použit lock-in zesilovač Stanford Research System SR830 DSP řízený sběrnicí IEEE 488. Toto nastavení umožňuje měřit normalizované změny vodivosti již od 0,01 %. Odpor snímače byl průběžně získáván během experimentů. Experimenty se snímáním byly průběžně prováděny s použitím následných expozičních cyklů (viz SOI, část 2).

ANALÝZA DAT:

Extrakce funkcí. Pro analýzu VOC jsou z každé odezvy senzoru extrahovány tři parametry: (i) normalizovaná změna odporu senzoru uprostřed expozice (S1); (ii) normalizovaná změna odporu snímače na konci expozice (S2); a (iii) plocha pod křivkou odezvy (S3). S1 a S2 jsou vypočteny s ohledem na hodnotu odporu snímače před expozicí. Pro analýzu dechu jsou z každé odezvy senzoru extrahovány dva parametry (buď na kontrolní VOC nebo na každé uvolnění vzorku dechu): (i) normalizovaná změna odporu senzorů brzy po expozici (S4); a (ii) normalizovanou změnu odporu snímačů uprostřed expozice (S5). S4 a S5 jsou vypočteny s ohledem na hodnotu odporu snímače před expozicí. Na tyto parametry je následně aplikován kompenzační a kalibrační proces, aby se z odezev snímače zachovaly pouze informace související s jejich odezvou na VOC ze vzorků dechu. Poté se vypočítají střední hodnoty parametrů získané během dvou po sobě jdoucích expozic stejnému vzorku.