Nanotechnológia a szklerózis multiplex kimutatására az autoimmun és neurológiai betegségekkel összehasonlítva kilélegzett minták alapján

Az SM a leggyakoribb krónikus neurológiai betegség, amely fiatal felnőtteket érint, és általában 20-40 éves korban kezdődik. A nők 3-4-szer gyakrabban érintettek, mint a férfiak. Ez egy összetett, többtényezős betegség, melynek hátterében mind genetikai, mind környezeti tényezők állnak. A különböző populációk eltérő érzékenységgel rendelkeznek (Compston és Coles 2008).

A betegséget 2 fő fenotípus jellemzi: visszaeső-remittáló vagy progresszív lefolyás. A klinikai fogyatékosság oka a központi idegrendszer mielinének (főleg oligodendrociták) 3 folyamat miatti pusztulása (Franklin 2002; Franklin és Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. Gyulladás – rendellenes aktivitású immunsejtek behatolnak az agyba és a gerincvelőbe, és a központi idegrendszer mielinének pusztulását idézik elő (a folyamatot demyelinizációnak és másodlagos neurodegenerációnak nevezik – axon- és neuronvesztés)
2. Elsődleges neurodegeneráció (axonális és neuronális veszteség) - kiemelkedő gyulladás nélkül

3. Repair – a gyulladásos és neurodegeneratív folyamatokat a központi idegrendszer helyreállítási kísérlete követi – azonban ez a részleges és hiányos helyreállítás gyakran a maradék hiányok és rokkantság alapja (Chandran, Hunt et al. 2008).

   • Az akut SM-relapszus (bénulás, látásvesztés stb. formájában) - a központi idegrendszerben fellépő rendellenes akut immunaktiváció és gyulladásos folyamat következménye.
   • A krónikus halmozódó fogyatékosság - a neurodegeneratív folyamat következményeként tekinthető.

A helyreállítási folyamatok főként az akut relapszus után figyelhetők meg - és a funkció helyreállítása spontán is lehet. Súlyos relapszusok esetén azonban néha SZTEROID KEZELÉSRE van szükség (Tischner és Reichardt 2007).

A betegség jobb megismerését követően az elmúlt 10-15 évben új immunterápiákat (COPAXON /; Interferon -beta ) fejlesztettek ki a hosszú távú kezelésre. Ezek azonban mérsékelhetik a betegséget (csökkenthetik az éves visszaesések számát), de nem gyógyítják meg. Ezenkívül a relapszusos-remittáló betegek mindössze ~40%-ánál előnyösek. Jelenleg nincs kezelés a progresszív betegségben szenvedő betegek számára – akiknek rokkantsága fokozatosan nőtt (Murray 2006).

Jelenleg nem állnak rendelkezésre biomarkerek az SM diagnosztizálására és rutinszerű követésére. Oligoklonális IgG a CSF-ben – amelyek segítenek a diagnózis megerősítésében, invazív eljárást igényelnek, és nem állnak összefüggésben a betegség aktivitásával vagy a terápiára adott válaszokkal; és az MRI, amely lehetővé teszi az SM aktivitásának nyomon követését, és a kezelésre adott válasz túl drága a rutinszerű használathoz (Link és Huang 2006; Murray 2006).

Dr. Hossam Haick, a Techniontól egy elektronikus orrot fejlesztett ki a betegségek légzésminták segítségével történő diagnosztizálására. Dr. Haick korábbi tanulmányai kimutatták, hogy az arany nanorészecskéken alapuló elektronikus orr egy olcsó és nem invazív diagnosztikai eszköz alapját képezheti a tüdőrák (Peng, Tisch és mtsai 2009) és a vesebetegségek (Haick, Hakim és mtsai, 2009) számára. ).

Kutatási hipotézis A központi idegrendszeri gyulladás és/vagy a neurodegeneráció és/vagy a központi idegrendszer helyreállításának biomarkerei az „elektronikus orr” segítségével kimutathatók SM-ben szenvedő személyek leheletmintájában.

Cél(ok)

A biomarkerek azonosítása:

1. CNS-gyulladás és CNS-autoimmunitás
2. Neurodegeneráció

3. CNS javítás

   • amelyek markereként szolgálhatnak a következőkhöz: betegség (a kontrollokhoz képest), betegség aktivitása (agresszív betegség lefolyásának előrejelzése, visszaesés előrejelzése; rosszindulatú vs jóindulatú MS előrejelzése); terápiára adott válasz (szteroid, immunterápia vagy neuroprotektív szerek).

A munkaterv vázlata:

Néhány csoport klinikai értékelése:

• SM betegek akut relapszusban 7, 30 és 90 napos szteroid kezelést követően - az akut gyulladásos folyamat indikátorainak és a szteroid kezelés hatásainak felmérésére.
• Relapszusos SM-betegek vs progresszív SM-betegek vs kontrollok, amelyek egészséges egyéneket, valamint az SM-től eltérő neurológiai és autoimmun betegségben szenvedőket foglalnak magukban - a gyulladásos és a neurodegeneratív mutatók értékelésére.
• Az immunterápiára vagy a szteroidokra jól reagáló SM-betegek.

LÉLEGZÉS GYŰJTÉS:

Az önkéntesek alveoláris leheletét „offline” módszerrel gyűjtik össze, amely hatékonyan elválasztja az endogén és az exogén lehelet illékony biomarkereit, és kizárja az orr-elzáródást. Önkéntesenként két 750 ml-es leheletmintát tartalmazó zacskót inert Mylar tasakokba gyűjtünk (Eco Medics, Duerten, Svájc). A gőzmintavételt 15-20 percig tartó kilélegzett mintavétellel végeztük a gyűjtőkészülékbe, a folyamat során többszöri megállással. A légúti mintavétel első három percét a felső légúti levegő esetleges szennyeződése miatt el kell hagyni. Az ezt követő mélylevegőt visszatartják vizsgálati célokra. A mintákat az önkéntes szájába helyezett és a gyűjtőzsákhoz csatlakoztatott csővel gyűjtik. Minden résztvevő aláírt, tájékozott beleegyezését adja ehhez a vizsgálathoz, amelyet a Carmel Medical Center Helsinki Bizottsága és a Technion humánkísérletek felügyeletével foglalkozó bizottsága jóváhagyását követően és irányelvei szerint hajtanak végre.

A LÉGZETI MINTÁK KÉMIAI ELEMZÉSE:

A gázkromatográfiát/tömegspektrometriát (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, Japán) termikus deszorpciós rendszerrel (TD20; Shimadzu Corporation, Japán) kombinálva használják a leheletminták kémiai elemzésére. Tenax® TA adszorbens csövet (Sigma Aldrich Ltd.) alkalmaznak a levegőminták VOC-jainak előkoncentrálására. Egyedi szivattyúrendszerrel a Mylar zsákokból származó leheletmintákat a TA csövön keresztül 100 ml/perc áramlási sebességgel szívják fel, majd egy termikus deszorpciós (TD) csőbe (Sigma Aldrich Ltd.) továbbítják elemzés előtt. GC-MS segítségével. A következő sütő hőmérsékleti profilt állítottuk be: (a) 10 perc 35 °C-on; (b) 4 °C/perc emelkedés 150 °C-ig; (c) 10 °C/perc rámpa 300 °C-ig; és (d) 15 percig 300 °C-on. SLB-5ms kapilláris oszlopot (Sigma Aldrich Ltd.) alkalmazunk 5% fenil-metil-sziloxánnal (30 m hosszú, 0,25 mm belső átmérő és 0,5 μm vastagság). Az osztott befecskendezési módot 2 percig használjuk, 30 cm/sec állandó lineáris sebességgel és 0,70 ml/perc oszlopáramlással. A VOC molekulaszerkezetét a standard moduláris készlet segítségével határozzuk meg, 10 ppm izobutilént (Calgaz, Cambridge, Maryland, USA) használva standard kalibrációs gázként minden egyes futtatás során. A GC-MS kromatogram analízist a GCMS Solutions 2.53SU1 verziójú futás utáni elemzési program (Shimadzu Corporation) segítségével valósítják meg, a National Institute of Standards and Technology (NIST) vegyületkönyvtárának (Gaithersburg, MD 20899-1070, USA) felhasználásával.

ÉRZÉKELŐ MÉRÉSEK:

A leheletminták és a detektor közötti kölcsönhatás során az illékony szerves vegyületek az érzékelőanyag szerves részébe adszorbeálódnak. Az adszorpció eredménye elektromos jellé (ellenállás) alakul, amely a makrovilágba (pl. a képernyőre) kerül. az eszköz) az ugyanabban a filmben található (fél)vezető anyagon keresztül. Az eredmények ezután megjelennek a számítógép képernyőjén.

Az érzékelési mérések elvégzésére egy egyedi LabView (National Instruments) program által vezérelt automatizált rendszert használnak. Az érzékelőket egyidejűleg, ugyanabban az expozíciós kamrában tesztelik egy Agilent 34980A többfunkciós kapcsolóval. IEEE 488 busz által vezérelt Stanford Research System SR830 DSP reteszelő erősítő szolgál a váltakozó feszültség jel ellátására (0,2 V 1 kHz-en) és a megfelelő áram mérésére (<10 μA a vizsgált eszközökben). Ez a beállítás lehetővé teszi a vezetőképesség normalizált változásainak mérését akár 0,01%-ig. A kísérletek során folyamatosan mértük az érzékelő ellenállását. Az érzékelési kísérleteket folyamatosan végeztük a következő expozíciós ciklusokkal (lásd SOI, 2. fejezet).

ADATELEMZÉS:

Jellemzők kitermelés. A VOC elemzéshez három paramétert vonunk ki minden egyes szenzorválaszból: (i) az érzékelő ellenállásának normalizált változása az expozíció közepén (S1); ii. az érzékelő ellenállásának normalizált változása az expozíció végén (S2); és (iii) a válaszgörbe alatti terület (S3). Az S1 és S2 kiszámítása az érzékelő ellenállásának expozíció előtti értékére vonatkozik. A leheletelemzéshez két paramétert vonnak ki minden egyes szenzorválaszból (akár a kontroll VOC-ra, akár a leheletminta minden egyes kibocsátására): (i) az érzékelők ellenállásának normalizált változása röviddel az expozíció után (S4); és (ii) az érzékelő ellenállásának normalizált változása az expozíció közepén (S5). Az S4 és S5 kiszámítása az érzékelő ellenállásának az expozíció előtti értékére vonatkozik. Ezekre a paraméterekre utólag egy kompenzációs és kalibrációs folyamatot alkalmaznak, hogy az érzékelő válaszaiból csak azokat az információkat tartsák meg, amelyek a leheletmintákból származó VOC-kra adott válaszukra vonatkoznak. Ezután kiszámítják az ugyanazon mintán végzett két egymást követő expozíció során kapott paraméterek átlagértékeit.