Nanotechnologie zum Nachweis von Multipler Sklerose im Vergleich zu Autoimmun- und neurologischen Erkrankungen durch ausgeatmete Proben

MS ist die häufigste chronische neurologische Erkrankung, die junge Erwachsene betrifft, und beginnt normalerweise im Alter von 20 bis 40 Jahren. Frauen sind 3-4 mal häufiger betroffen als Männer. Es ist eine komplexe multifaktorielle Erkrankung, der sowohl genetische als auch umweltbedingte Faktoren zugrunde liegen. Unterschiedliche Populationen haben unterschiedliche Anfälligkeiten (Compston und Coles 2008).

Die Krankheit ist durch 2 Hauptphänotypen gekennzeichnet: schubförmig remittierender oder progressiver Verlauf. Die klinische Behinderung beruht auf der Zerstörung des ZNS-Myelins (hauptsächlich Oligodendrozyten) aufgrund von 3 Prozessen (Franklin 2002; Franklin und Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. Entzündung – Immunzellen mit abweichender Aktivität dringen in Gehirn und Rückenmark ein und verursachen die Zerstörung des ZNS-Myelins (ein Prozess, der als Demyelinisierung und sekundäre Neurodegeneration bezeichnet wird – axonaler und neuronaler Verlust)
2. Primäre Neurodegeneration (axonaler und neuronaler Verlust) – ohne ausgeprägte Entzündung

3. Reparatur – auf die entzündlichen und neurodegenerativen Prozesse folgt ein Reparaturversuch des ZNS – jedoch ist diese teilweise und unvollständige Reparatur oft die Grundlage für verbleibende Defizite und Behinderungen (Chandran, Hunt et al. 2008) .

   • Der akute MS-Rückfall (dargestellt als Lähmung, Sehverlust usw.) wird als Folge einer anormalen akuten Immunaktivierung und eines entzündlichen Prozesses im ZNS betrachtet.
   • Die chronisch zunehmende Behinderung – wird als Folge des neurodegenerativen Prozesses angesehen.

Reparaturprozesse werden hauptsächlich nach dem akuten Rückfall bemerkt - und die Wiederherstellung der Funktion kann spontan sein. Bei schweren Rückfällen ist jedoch manchmal eine STEROIDBEHANDLUNG erforderlich (Tischner und Reichardt 2007).

Aufgrund des zunehmenden Verständnisses der Krankheit wurden in den letzten 10-15 Jahren neue Immuntherapien (COPAXON/; Interferon-beta) für die Langzeitbehandlung entwickelt. Diese können die Krankheit jedoch abschwächen (die Zahl der Schübe pro Jahr verringern), sie aber nicht heilen. Darüber hinaus sind sie nur bei ~40 % der schubförmig remittierenden Patienten von Vorteil. Gegenwärtig gibt es keine Behandlungen für Patienten mit progressiver Erkrankung – die eine allmählich zunehmende Behinderung aufweisen (Murray 2006).

Derzeit sind keine Biomarker für die Diagnose und routinemäßige Nachsorge von MS verfügbar. Oligoklonale IgG im Liquor – die zur Bestätigung der Diagnose beitragen, ein invasives Verfahren erfordern und nicht mit der Krankheitsaktivität oder dem Ansprechen auf die Therapie korrelieren; und MRT, das die Überwachung der MS-Aktivität und des Ansprechens auf die Behandlung ermöglicht, ist für den routinemäßigen Einsatz zu teuer (Link und Huang 2006; Murray 2006).

Dr. Hossam Haick vom Technion entwickelte eine elektronische Nase zur Diagnose von Krankheiten über Atemproben. Dr. Haicks frühere Studien haben gezeigt, dass eine elektronische Nase auf Basis von Gold-Nanopartikeln die Grundlage für ein kostengünstiges und nicht-invasives Diagnosewerkzeug für Lungenkrebs (Peng, Tisch et al. 2009) und Nierenerkrankungen (Haick, Hakim et al. 2009) bilden könnte ).

Forschungshypothese Biomarker der ZNS-Entzündung und/oder Neurodegeneration und/oder ZNS-Reparatur können durch die „elektronische Nase“ in Atemproben von Personen mit MS nachgewiesen werden.

Ziel(e)

Identifizierung von Biomarkern von:

1. ZNS-Entzündung und ZNS-Autoimmunität
2. Neurodegeneration

3. ZNS-Reparatur

   • die als Marker dienen können für: Krankheit (vs. Kontrollen), Krankheitsaktivität (Vorhersage eines aggressiven Krankheitsverlaufs, Vorhersage eines Rückfalls; Vorhersage bösartiger vs. benigner MS); Ansprechen auf eine Therapie (Steroid, Immuntherapien oder neuroprotektive Mittel).

Gliederung des Arbeitsplans:

Bewerten Sie einige Gruppen klinisch:

• MS-Patienten bei akutem Rückfall vor – vs. nach 7, 30 und 90 Tagen Steroidbehandlung – zur Beurteilung von Indikatoren des akuten Entzündungsprozesses und der Wirkungen der Steroidbehandlung.
• Patienten mit schubförmiger MS im Vergleich zu Patienten mit progressiver MS im Vergleich zu Kontrollpersonen, die sowohl gesunde Personen als auch Patienten umfassen, die an anderen neurologischen und Autoimmunerkrankungen als MS leiden, um entzündliche vs. neurodegenerative Indikatoren zu bewerten.
• MS-Patienten, die gut oder schlecht auf eine Immuntherapie oder Steroide ansprechen.

ATEMSAMMLUNG:

Der alveoläre Atem der Freiwilligen wird unter Verwendung einer "Offline"-Methode gesammelt, die die endogenen flüchtigen Biomarker der exogenen Atemluft effektiv trennt und die nasale Mitnahme ausschließt. Zwei Beutel mit 750 ml Atemproben pro Freiwilliger werden in inerten Mylarbeuteln (Eco Medics, Dürten, Schweiz) gesammelt. Die Dampfprobenahme wurde durch verlängerte Atemprobenahme in die Sammelvorrichtung für 15–20 Minuten durchgeführt, mit mehreren Unterbrechungen während dieses Vorgangs. Die ersten drei Minuten der Atemprobenahme werden wegen der möglichen Kontamination der oberen Atemluft verworfen. Die anschließende Tiefenluft wird zu Testzwecken zurückgehalten. Die Proben werden mit einem Schlauch gesammelt, der in den Mund des Probanden eingeführt und mit dem Sammelbeutel verbunden wurde. Alle Teilnehmer geben eine unterschriebene Einverständniserklärung zu dieser Studie ab, die nach der Genehmigung und gemäß den Richtlinien des Helsinki Committee of Carmel Medical Center und des Technion-Komitees zur Überwachung von Experimenten am Menschen durchgeführt wird.

CHEMISCHE ANALYSE DER ATEMPROBEN:

Gas-Chromatographie/Massenspektrometrie (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, Japan), kombiniert mit einem Thermodesorptionssystem (TD20; Shimadzu Corporation, Japan), wird für die chemische Analyse der Atemproben verwendet. Zur Vorkonzentration der VOCs in den Atemproben wird ein Adsorptionsröhrchen Tenax® TA (Sigma Aldrich Ltd.) verwendet. Unter Verwendung eines maßgeschneiderten Pumpensystems werden die Atemproben aus den Mylar-Beutel mit einer Flussrate von 100 ml/min durch das TA-Rohr gesaugt und dann vor der Analyse in ein Thermodesorptionsröhrchen (TD) (Sigma Aldrich Ltd.) überführt durch GC-MS. Das folgende Ofentemperaturprofil wurde eingestellt: (a) 10 min bei 35°C; (b) Anstieg um 4°C/min bis 150°C; (c) 10°C/min Rampe bis 300°C; und (d) 15 min bei 300°C. Eingesetzt wird eine SLB-5ms-Kapillarsäule (Sigma Aldrich Ltd.) mit 5 % Phenylmethylsiloxan (30 m Länge, 0,25 mm Innendurchmesser und 0,5 µm Dicke). Der Splitless-Injektionsmodus wird für 2 min bei einer konstanten linearen Geschwindigkeit von 30 cm/s und einem Säulenfluss von 0,70 ml/min verwendet. Die Molekularstrukturen der VOCs werden über das modulare Standardset bestimmt, wobei bei jedem Durchlauf 10 ppm Isobutylen (Calgaz, Cambridge, Maryland, USA) als Standardkalibriergas verwendet werden. Die GC-MS-Chromatogrammanalyse wird unter Verwendung des Post-Run-Analyseprogramms GCMS-Lösungen Version 2.53SU1 (Shimadzu Corporation) unter Verwendung der Verbindungsbibliothek des National Institute of Standards and Technology (NIST) (Gaithersburg, MD 20899–1070, USA) realisiert.

SENSOR-MESSUNGEN:

Bei der Wechselwirkung zwischen den Atemproben und dem Detektor adsorbieren die flüchtigen organischen Verbindungen im organischen Teil des Sensormaterials. Das Ergebnis dieser Adsorption wird in ein elektrisches Signal (Widerstand) übersetzt, das an die Makrowelt (z. B. den Bildschirm) übertragen wird des Geräts) durch das (halb-)leitende Material, das sich in derselben Folie befindet. Die Ergebnisse werden dann auf dem Computerbildschirm präsentiert.

Ein automatisiertes System, das von einem benutzerdefinierten LabView-Programm (National Instruments) gesteuert wird, wird verwendet, um die Erfassungsmessungen durchzuführen. Die Sensoren werden gleichzeitig in derselben Expositionskammer mit einem Agilent 34980A Multifunktionsschalter getestet. Zur Bereitstellung des Wechselspannungssignals (0,2 V bei 1 kHz) und zur Messung des entsprechenden Stroms (<10 μA in den untersuchten Geräten) wird ein Stanford Research System SR830 DSP-Lock-In-Verstärker verwendet, der von einem IEEE 488-Bus gesteuert wird. Dieser Aufbau ermöglicht die Messung normalisierter Leitfähigkeitsänderungen von nur 0,01 %. Der Sensorwiderstand wurde während der Experimente kontinuierlich erfasst. Sensorexperimente wurden kontinuierlich unter Verwendung aufeinanderfolgender Expositionszyklen durchgeführt (siehe SOI, Abschnitt 2).

DATENANALYSE:

Merkmale extrahieren. Für die VOC-Analyse werden drei Parameter aus jeder Sensorantwort extrahiert: (i) die normalisierte Änderung des Sensorwiderstands in der Mitte der Exposition (S1); (ii) die normierte Änderung des Sensorwiderstands am Ende der Belichtung (S2); und (iii) die Fläche unter der Reaktionskurve (S3). S1 und S2 werden im Hinblick auf den Wert des Sensorwiderstands vor der Belichtung berechnet. Für die Atemanalyse werden zwei Parameter aus jeder Sensorantwort extrahiert (entweder auf die Kontroll-VOC oder auf jede Abgabe einer Atemprobe): (i) die normalisierte Änderung des Sensorwiderstands kurz nach der Exposition (S4); und (ii) die normalisierte Änderung des Sensorwiderstands in der Mitte der Belichtung (S5). S4 und S5 werden im Hinblick auf den Wert des Sensorwiderstands vor der Belichtung berechnet. Ein Kompensations- und Kalibrierungsprozess wird nachträglich auf diese Parameter angewendet, um aus den Sensorreaktionen nur die Informationen zu behalten, die sich auf ihre Reaktion auf die VOCs aus den Atemproben beziehen. Dann werden die Mittelwerte der Parameter, die über die beiden aufeinanderfolgenden Expositionen derselben Probe erhalten wurden, berechnet.