Nanotecnologia per il rilevamento della sclerosi multipla rispetto alle malattie autoimmuni e neurologiche mediante campioni espirati

La SM è la più comune malattia neurologica cronica che colpisce i giovani adulti, con insorgenza solitamente all'età di 20-40 anni. Le donne sono colpite 3-4 volte di più degli uomini. È una malattia multifattoriale complessa, con sottostanti fattori sia genetici che ambientali. Popolazioni diverse hanno suscettibilità diversa (Compston e Coles 2008).

La malattia è caratterizzata da 2 fenotipi principali: decorso recidivante-remittente o progressivo. La disabilità clinica è dovuta alla distruzione della mielina del SNC (principalmente oligodendrociti) dovuta a 3 processi (Franklin 2002; Franklin e Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. Infiammazione: le cellule immunitarie con attività aberrante invadono il cervello e il midollo spinale e causano la distruzione della mielina del SNC (un processo chiamato demielinizzazione e neurodegenerazione secondaria - perdita assonale e neuronale)
2. Neurodegenerazione primaria (perdita assonale e neuronale) - senza infiammazione prominente

3. Riparazione - i processi infiammatori e neurodegenerativi sono seguiti da un tentativo di riparazione del SNC - tuttavia, questa riparazione parziale e incompleta è spesso alla base di deficit residui e disabilità (Chandran, Hunt et al. 2008).

   • La ricaduta acuta della SM (presentata come paralisi, perdita della vista, ecc.) - è considerata dovuta a un'attivazione immunitaria acuta aberrante e a un processo infiammatorio nel sistema nervoso centrale.
   • La disabilità accumulativa cronica - è considerata dovuta al processo neurodegenerativo.

I processi di riparazione si notano principalmente dopo la ricaduta acuta e il recupero della funzione può essere spontaneo. Tuttavia, nelle ricadute gravi a volte è necessario un TRATTAMENTO STEROIDICO (Tischner e Reichardt 2007).

A seguito della maggiore comprensione della malattia, negli ultimi 10-15 anni sono state sviluppate nuove immunoterapie (COPAXON /; Interferone-beta) per il trattamento a lungo termine. Tuttavia questi possono attenuare la malattia (ridurre il numero di recidive all'anno) ma non curarla. Inoltre, sono utili solo in circa il 40% dei pazienti recidivanti-remittente. Attualmente non ci sono trattamenti per i pazienti con la malattia progressiva - che hanno un graduale aumento della disabilità (Murray 2006).

Attualmente non sono disponibili biomarcatori per la diagnosi e il follow-up di routine della SM. IgG oligoclonali nel liquido cerebrospinale - che aiutano a confermare la diagnosi, richiedono una procedura invasiva e non sono correlate all'attività della malattia né alla risposta alla terapia; e la risonanza magnetica, che consente il monitoraggio dell'attività della SM e la risposta al trattamento è troppo costosa per l'uso di routine (Link e Huang 2006; Murray 2006).

Il dottor Hossam Haick del Technion, ha sviluppato un naso elettronico per la diagnosi delle malattie tramite campioni di respiro. I precedenti studi del dottor Haick hanno dimostrato che un naso elettronico basato su nanoparticelle d'oro potrebbe costituire la base di uno strumento diagnostico economico e non invasivo per il cancro del polmone (Peng, Tisch et al. 2009) e le malattie renali (Haick, Hakim et al. 2009 ).

Ipotesi di ricerca Biomarcatori di infiammazione e/o neurodegenerazione e/o riparazione del SNC possono essere rilevati dal "naso elettronico" in campioni di respiro di persone con SM.

Obiettivi)

Identificazione di biomarcatori di:

1. Infiammazione del SNC e autoimmunità del SNC
2. Neurodegenerazione

3. Riparazione del SNC

   • che possono servire come marcatori per: malattia (rispetto ai controlli), attività della malattia (previsione del decorso aggressivo della malattia, previsione della ricaduta; previsione della SM maligna rispetto a quella benigna); risposta alla terapia (steroidi, immunoterapie o agenti neuroprotettivi).

Schema del piano di lavoro:

Valutare clinicamente alcuni gruppi:

• Pazienti con SM in recidiva acuta pre - vs - dopo 7, 30 e 90 giorni di trattamento con steroidi - per valutare gli indicatori del processo infiammatorio acuto e degli effetti del trattamento con steroidi.
• Pazienti con SM recidivante rispetto a pazienti con SM progressiva rispetto a controlli che includono individui sani e pazienti affetti da malattie neurologiche e autoimmuni diverse dalla SM - per valutare gli indicatori infiammatori rispetto a quelli neurodegenerativi.
• Pazienti con SM che rispondono in modo buono o scarso all'immunoterapia o agli steroidi.

RACCOLTA DEL RESPIRO:

Il respiro alveolare dei volontari viene raccolto utilizzando un metodo "offline" che separa efficacemente i biomarcatori volatili endogeni da quelli esogeni ed esclude il trascinamento nasale. Due sacche da 750 ml di campioni di respiro per volontario vengono raccolte in sacche di Mylar inerte (Eco Medics, Duerten, Svizzera). Il campionamento del vapore è stato eseguito mediante campionamento prolungato del respiro nell'apparato di raccolta per 15-20 minuti, con diverse interruzioni durante questo processo. I primi tre minuti di campionamento del respiro vengono scartati a causa della possibile contaminazione dell'aria delle vie respiratorie superiori. L'aria profonda successiva viene trattenuta a scopo di test. I campioni vengono raccolti con un tubo introdotto nella bocca del volontario e collegato alla sacca di raccolta. Tutti i partecipanti forniscono un consenso informato firmato a questo studio, che viene eseguito dopo l'approvazione e secondo le linee guida del Comitato di Helsinki del Carmel Medical Center e del Comitato del Technion per la supervisione degli esperimenti sugli esseri umani.

ANALISI CHIMICA DEI CAMPIONI DI RESPIRO:

La gascromatografia/spettrometria di massa (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, Giappone), combinata con un sistema di desorbimento termico (TD20; Shimadzu Corporation, Giappone), viene utilizzata per l'analisi chimica dei campioni di respiro. Un tubo adsorbente Tenax® TA (Sigma Aldrich Ltd.) viene impiegato per pre-concentrare i COV nei campioni di respiro. Utilizzando un sistema di pompa su misura, i campioni di respiro dalle sacche di Mylar vengono aspirati attraverso il tubo TA a una portata di 100 ml/min, per poi essere trasferiti in un tubo di desorbimento termico (TD) (Sigma Aldrich Ltd.) prima di essere analizzati da GC-MS. È stato impostato il seguente profilo di temperatura del forno: (a) 10 min a 35°C; (b) rampa di 4°C/min fino a 150°C; (c) rampa di 10°C/min fino a 300°C; e (d) 15 min a 300°C. Viene impiegata una colonna capillare SLB-5ms (Sigma Aldrich Ltd.) con fenil metil silossano al 5% (30 m di lunghezza, 0,25 mm di diametro interno e 0,5 μm di spessore). La modalità di iniezione splitless viene utilizzata per 2 minuti, a una velocità lineare costante di 30 cm/sec e un flusso della colonna di 0,70 ml/min. Le strutture molecolari dei COV sono determinate tramite il set modulare standard, utilizzando 10 ppm di isobutilene (Calgaz, Cambridge, Maryland, USA) come gas di calibrazione standard durante ogni corsa. L'analisi del cromatogramma GC-MS viene realizzata utilizzando il programma di analisi post-analisi delle soluzioni GCMS versione 2.53SU1 (Shimadzu Corporation), impiegando la libreria di composti del National Institute of Standards and Technology (NIST) (Gaithersburg, MD 20899-1070, USA).

MISURE DI SENSORE:

All'interazione tra i campioni di respiro e il rivelatore, i composti organici volatili si adsorbono nella parte organica del materiale di rilevamento Il risultato di questo adsorbimento viene tradotto in un segnale elettrico (resistenza) che viene trasmesso al macro-mondo (ad esempio, lo schermo del dispositivo) attraverso il materiale (semi)conduttivo presente nella stessa pellicola. I risultati vengono poi presentati sullo schermo del computer.

Per eseguire le misurazioni di rilevamento viene utilizzato un sistema automatizzato controllato da un programma LabView (National Instruments) personalizzato. I sensori vengono testati contemporaneamente, nella stessa camera di esposizione, utilizzando un interruttore multifunzione Agilent 34980A. Un amplificatore lock-in Stanford Research System SR830 DSP controllato da un bus IEEE 488 viene utilizzato per fornire il segnale di tensione AC (0,2 V a 1 kHz) e per misurare la corrente corrispondente (<10μA nei dispositivi studiati). Questa configurazione consente di misurare le variazioni normalizzate della conduttanza fino allo 0,01%. La resistenza del sensore è stata acquisita continuamente durante gli esperimenti. Gli esperimenti di rilevamento sono stati eseguiti continuamente utilizzando successivi cicli di esposizione (vedere SOI, sezione 2).

ANALISI DEI DATI:

Caratteristiche di estrazione. Per l'analisi VOC, tre parametri vengono estratti da ciascuna risposta del sensore: (i) il cambiamento normalizzato della resistenza del sensore al centro dell'esposizione (S1); (ii) la variazione normalizzata della resistenza del sensore al termine dell'esposizione (S2); e (iii) l'area sotto la curva di risposta (S3). S1 e S2 sono calcolati rispetto al valore della resistenza del sensore prima dell'esposizione. Per l'analisi dell'espirato, vengono estratti due parametri da ciascuna risposta del sensore (sia per il VOC di controllo che per ogni rilascio di campione di espirato): (i) la variazione normalizzata della resistenza dei sensori subito dopo l'esposizione (S4); e (ii) il cambiamento normalizzato della resistenza dei sensori al centro dell'esposizione (S5). S4 e S5 sono calcolati rispetto al valore della resistenza del sensore prima dell'esposizione. A questi parametri viene applicato posteriormente un processo di compensazione e calibrazione per conservare dalle risposte dei sensori solo le informazioni relative alla loro risposta ai COV dai campioni di respiro. Vengono quindi calcolati i valori medi dei parametri ottenuti sulle due successive esposizioni allo stesso campione.