호기 샘플에 의한 자가면역 및 신경계 질환과 비교한 다발성 경화증 검출을 위한 나노기술

다발성 경화증은 젊은 성인에게 영향을 미치는 가장 흔한 만성 신경계 질환으로, 일반적으로 20-40세에 발병합니다. 여성이 남성보다 3-4배 더 영향을 받습니다. 유전적 요인과 환경적 요인이 모두 작용하는 복잡한 다인성 질환입니다. 인구마다 감수성이 다릅니다(Compston and Coles 2008).

이 질병은 2가지 주요 표현형, 즉 재발-완화 또는 진행 과정을 특징으로 합니다. 임상 장애는 3가지 프로세스로 인한 CNS 미엘린(주로 희소돌기아교세포)의 파괴로 인해 발생합니다(Franklin 2002; Franklin and Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. 염증 - 비정상적인 활동을 하는 면역 세포가 뇌와 척수를 침범하여 CNS 미엘린 파괴를 일으킴(탈수초화 및 이차 신경변성 - 축삭 및 신경세포 손실)
2. 원발성 신경변성(축삭 및 신경세포 손실) - 눈에 띄는 염증 없음

3. 수선 - 염증 및 신경변성 과정 후에 CNS가 수선을 시도하지만, 이 부분적이고 불완전한 수선은 종종 잔여 결손 및 장애의 기초가 됩니다(Chandran, Hunt et al. 2008).

   • 급성 MS 재발(마비, 시력 상실 등으로 나타남)은 CNS에서 비정상적인 급성 면역 활성화 및 염증 과정으로 인한 것으로 간주됩니다.
   • 만성 축적 장애는 신경 퇴행성 과정으로 인한 것으로 간주됩니다.

회복 과정은 급성 재발 후에 주로 나타나며 기능 회복은 자발적일 수 있습니다. 그러나 심각한 재발의 경우 때때로 스테로이드 치료가 필요합니다(Tischner and Reichardt 2007).

질병에 대한 이해가 높아짐에 따라 지난 10-15년 동안 장기 치료를 위한 새로운 면역 요법(COPAXON/; 인터페론-베타)이 개발되었습니다. 그러나 이들은 질병을 약화시킬 수 있지만(연간 재발 횟수를 줄임) 완치하지는 못합니다. 또한 재발-완화 환자의 ~40%에서만 유익합니다. 현재 점진적으로 장애가 증가하는 진행성 질환 환자를 위한 치료법은 없습니다(Murray 2006).

현재 MS의 진단 및 일상적인 후속 조치에 사용할 수 있는 바이오마커는 없습니다. CSF의 Oligoclonal IgG - 진단을 확인하는 데 도움이 되고 침습적 절차가 필요하며 질병 활동이나 치료에 대한 반응과 관련이 없습니다. 및 MS 활동 및 치료 반응을 모니터링할 수 있는 MRI는 일상적인 사용에 너무 비쌉니다(Link and Huang 2006; Murray 2006).

Technion의 Hossam Haick 박사는 호흡 샘플을 통해 질병을 진단하는 전자 코를 개발했습니다. Haick 박사의 이전 연구는 금 나노입자를 기반으로 하는 전자 코가 폐암(Peng, Tisch et al. 2009) 및 신장 질환(Haick, Hakim et al. 2009)에 대한 저렴하고 비침습적인 진단 도구의 기초를 형성할 수 있음을 보여주었습니다. ).

연구 가설 CNS 염증 및/또는 신경변성 및/또는 CNS 복구의 바이오마커는 MS 환자의 호흡 샘플에서 "전자 코"로 감지할 수 있습니다.

목표

다음의 바이오마커 식별:

1. CNS 염증 및 CNS 자가면역
2. 신경변성

3. CNS 수리

   • 질병(대조군), 질병 활동(공격적인 질병 과정 예측, 재발 예측, 악성 대 양성 MS 예측)에 대한 마커 역할을 할 수 있습니다. 치료에 대한 반응(스테로이드, 면역 요법 또는 신경 보호제).

작업 계획 개요:

몇몇 그룹을 임상적으로 평가합니다.

• 스테로이드 치료 7일, 30일 및 90일 전 - 후 급성 재발의 MS 환자 - 급성 염증 과정 및 스테로이드 치료 효과의 지표를 평가합니다.
• 재발성 MS 환자 대 진행성 MS 환자 대 염증 대 신경변성 지표를 평가하기 위해 MS 이외의 신경학적 및 자가면역 질환을 앓고 있는 환자뿐만 아니라 건강한 개인을 포함하는 대조군.
• 면역요법 또는 스테로이드에 대한 반응이 양호하거나 불량한 MS 환자.

호흡 수집:

지원자의 폐포 호흡은 외인성 호흡 휘발성 바이오마커로부터 내인성을 효과적으로 분리하고 코 동반을 배제하는 "오프라인" 방법을 사용하여 수집됩니다. 지원자당 호흡 샘플 750 ml의 2개 백을 비활성 마일라 백(Eco Medics, Duerten, Switzerland)에 수집합니다. 증기 샘플링은 15-20분 동안 수집 장치로 확장된 호흡 샘플링에 의해 수행되었으며, 이 과정 동안 여러 번 중지되었습니다. 호흡 샘플링의 처음 3분은 상기도 공기의 오염 가능성으로 인해 폐기됩니다. 후속 깊은 공기는 테스트 목적으로 유지됩니다. 샘플은 지원자의 입에 삽입되고 수집 백에 연결된 튜브로 수집됩니다. 모든 참가자는 이 연구에 대한 서명된 정보에 입각한 동의를 제공하며, 이는 승인 후 Carmel Medical Center의 헬싱키 위원회와 인체 실험 감독을 위한 Technion 위원회의 지침에 따라 수행됩니다.

호흡 샘플의 화학적 분석:

열 탈착 시스템(TD20; Shimadzu Corporation, 일본)과 결합된 가스 크로마토그래피/질량 분석법(GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, 일본)은 호흡 샘플의 화학적 분석에 사용됩니다. Tenax® TA 흡착제 튜브(Sigma Aldrich Ltd.)는 호흡 샘플에서 VOC를 사전 농축하기 위해 사용됩니다. 맞춤형 펌프 시스템을 사용하여 Mylar 백의 호흡 샘플을 100ml/min 유속으로 TA 튜브를 통해 흡입한 다음 열 탈착(TD) 튜브(Sigma Aldrich Ltd.)로 옮겨 분석합니다. GC-MS에 의해. 다음 오븐 온도 프로파일이 설정되었습니다: (a) 35°C에서 10분; (b) 150℃까지 4℃/분 램프; (c) 300℃까지 10℃/분 램프; 및 (d) 300℃에서 15분. 5% 페닐 메틸 실록산(길이 30m, 내부 직경 0.25mm 및 두께 0.5μm)을 포함하는 SLB-5ms 모세관 컬럼(Sigma Aldrich Ltd.)을 사용합니다. 비분할 주입 모드는 30cm/초의 일정한 선형 속도 및 0.70ml/분의 컬럼 흐름에서 2분 동안 사용됩니다. VOC의 분자 구조는 각 실행 동안 표준 보정 가스로 10ppm 이소부틸렌(Calgaz, Cambridge, Maryland, USA)을 사용하여 표준 모듈 세트를 통해 결정됩니다. GC-MS 크로마토그램 분석은 NIST(National Institute of Standards and Technology) 화합물 라이브러리(Gaithersburg, MD 20899-1070, USA)를 사용하는 GCMS 솔루션 버전 2.53SU1 실행 후 분석 프로그램(Shimadzu Corporation)을 사용하여 실현됩니다.

감지 측정:

호흡 샘플과 감지기 간의 상호 작용 시 휘발성 유기 화합물이 감지 물질의 유기 부분에 흡착됩니다. 이 흡착의 결과는 매크로 세계(예: 화면)로 전송되는 전기 신호(저항)로 변환됩니다. 같은 필름에서 발견되는 (반)전도성 물질을 통해). 그러면 결과가 컴퓨터 화면에 표시됩니다.

맞춤형 LabView(National Instruments) 프로그램에 의해 제어되는 자동화 시스템은 감지 측정을 수행하는 데 사용됩니다. 센서는 Agilent 34980A 다기능 스위치를 사용하여 동일한 노출 챔버에서 동시에 테스트됩니다. IEEE 488 버스로 제어되는 Stanford Research System SR830 DSP 잠금 증폭기는 AC 전압 신호(1kHz에서 0.2V)를 공급하고 해당 전류(연구 장치에서 <10μA)를 측정하는 데 사용됩니다. 이 설정을 통해 0.01%만큼 작은 컨덕턴스의 정규화된 변화를 측정할 수 있습니다. 센서 저항은 실험 중에 지속적으로 획득되었습니다. 후속 노출 주기를 사용하여 감지 실험을 지속적으로 수행했습니다(SOI, 섹션 2 참조).

데이터 분석:

특징 추출. VOC 분석을 위해 각 센서 응답에서 세 가지 매개변수를 추출합니다. (i) 노출 중간에서 센서 저항의 정규화된 변화(S1); (ii) 노출 종료 시 센서 저항의 정규화된 변화(S2); 및 (iii) 응답 곡선 아래 면적(S3). S1 및 S2는 노출 전 센서 저항 값에 대해 계산됩니다. 호흡 분석을 위해 각 센서 응답(대조 VOC 또는 호흡 샘플의 각 릴리스)에서 두 개의 매개변수가 추출됩니다. (i) 노출 직후 센서 저항의 정규화된 변화(S4); 및 (ii) 노출 중간에 센서 저항의 정규화된 변화(S5). S4 및 S5는 노출 전 센서 저항 값에 대해 계산됩니다. 호흡 샘플의 VOC에 대한 응답과 관련된 정보만 센서 응답에서 유지하기 위해 보정 및 보정 프로세스가 이러한 매개변수에 사후에 적용됩니다. 그런 다음 동일한 샘플에 대한 두 번의 연속 노출을 통해 얻은 매개변수의 평균값을 계산합니다.