Nanotechnologie voor detectie van multiple sclerose in vergelijking met auto-immuunziekten en neurologische aandoeningen door middel van uitgeademde monsters

MS is de meest voorkomende chronische neurologische aandoening die jongvolwassenen treft en begint meestal op de leeftijd van 20-40 jaar. Vrouwen worden 3-4 keer meer getroffen dan mannen. Het is een complexe multifactoriële ziekte, met onderliggende zowel genetische als omgevingsfactoren. Verschillende populaties hebben verschillende gevoeligheid (Compston en Coles 2008).

De ziekte wordt gekenmerkt door 2 hoofdfenotypes: relapsing-remitting of progressief beloop. Klinische invaliditeit is te wijten aan vernietiging van de CZS-myeline (voornamelijk oligodendrocyten) als gevolg van 3 processen (Franklin 2002; Franklin en Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. Ontsteking - immuuncellen met afwijkende activiteit dringen de hersenen en het ruggenmerg binnen en veroorzaken vernietiging van CZS-myeline (een proces dat demyelinisatie en secundaire neurodegeneratie wordt genoemd - axonaal en neuronaal verlies)
2. Primaire neurodegeneratie (axonaal en neuronaal verlies) - zonder prominente ontsteking

3. Herstel - de ontstekings- en neurodegeneratieve processen worden gevolgd door een poging van het CZS om te herstellen - dit gedeeltelijke en onvolledige herstel is echter vaak de basis van resterende tekorten en invaliditeit (Chandran, Hunt et al. 2008).

   • De acute MS-terugval (gepresenteerd als verlamming, verlies van gezichtsvermogen, enz.) - wordt beschouwd als het gevolg van een afwijkende acute immuunactivatie en ontstekingsproces in het CZS.
   • De chronische accumulerende handicap - wordt verondersteld te wijten te zijn aan het neurodegeneratieve proces.

Herstelprocessen worden voornamelijk opgemerkt na de acute terugval - en herstel van functie kan spontaan zijn. Bij ernstige terugvallen is er echter soms behoefte aan een steroïdenbehandeling (Tischner en Reichardt 2007).

Naar aanleiding van het toegenomen begrip van de ziekte werden in de afgelopen 10-15 jaar nieuwe immunotherapieën ontwikkeld (COPAXON /; Interferon-beta) voor langdurige behandeling. Deze kunnen de ziekte echter verzwakken (het aantal recidieven per jaar verminderen), maar niet genezen. Bovendien zijn ze nuttig bij slechts ~ 40% van de relapsing-remitting-patiënten. Momenteel zijn er geen behandelingen voor patiënten met de progressieve ziekte - die een geleidelijk toenemende handicap hebben (Murray 2006).

Momenteel zijn er geen biomarkers beschikbaar voor de diagnose en routinematige follow-up van MS. Oligoklonaal IgG in de CSF - die de diagnose helpen bevestigen, een invasieve procedure vereisen en niet gecorreleerd zijn met ziekteactiviteit of respons op therapie; en MRI, waarmee de MS-activiteit en respons op behandeling kunnen worden gevolgd, is te duur voor routinematig gebruik (Link en Huang 2006; Murray 2006).

Dr. Hossam Haick van de Technion ontwikkelde een elektronische neus voor de diagnose van ziekten via ademmonsters. Dr. Haick's eerdere studies hebben aangetoond dat een elektronische neus op basis van gouden nanodeeltjes de basis zou kunnen vormen van een goedkoop en niet-invasief diagnostisch hulpmiddel voor longkanker (Peng, Tisch et al. 2009) en nierziekten (Haick, Hakim et al. 2009 ).

Onderzoekshypothese Biomarkers van CZS-ontsteking en/of neurodegeneratie en/of CZS-herstel kunnen worden opgespoord door de "elektronische neus" in ademmonsters van personen met MS.

Doel(en)

Identificatie van biomarkers van:

1. CZS-ontsteking en CZS-auto-immuniteit
2. Neurodegeneratie

3. CZS reparatie

   • die kunnen dienen als markers voor: ziekte (versus controles), ziekteactiviteit (voorspellen van agressief ziekteverloop, voorspellen van terugval; voorspellen van maligne versus goedaardige MS); reactie op therapie (steroïden, immunotherapieën of neuroprotectieve middelen).

Overzicht werkplan:

Evalueer enkele groepen klinisch:

• MS-patiënten met een acute terugval vóór versus na 7, 30 en 90 dagen behandeling met steroïden - om indicatoren van het acute ontstekingsproces en van de effecten van behandeling met steroïden te beoordelen.
• Terugvallende MS-patiënten versus progressieve MS-patiënten versus controles, waaronder gezonde personen en patiënten die lijden aan andere neurologische en auto-immuunziekten dan MS - om inflammatoire versus neurodegeneratieve indicatoren te beoordelen.
• MS-patiënten die goed of slecht reageren op immunotherapie of steroïden.

ADEM COLLECTIE:

Alveolaire adem van de vrijwilligers wordt verzameld met behulp van een "offline" methode die de endogene en exogene vluchtige biomarkers van de adem effectief scheidt en de nasale meevoering uitsluit. Twee zakken met 750 ml ademmonsters per vrijwilliger worden verzameld in inerte Mylar-zakken (Eco Medics, Duerten, Zwitserland). Dampbemonstering werd uitgevoerd door middel van verlengde adembemonstering in het verzamelapparaat gedurende 15-20 minuten, met verschillende stops tijdens dit proces. De eerste drie minuten ademmonsters worden weggegooid vanwege de mogelijke verontreiniging van de bovenste ademlucht. De daaropvolgende diepe lucht wordt vastgehouden voor testdoeleinden. De monsters worden verzameld met een buisje dat in de mond van de vrijwilliger wordt ingebracht en wordt aangesloten op de opvangzak. Alle deelnemers geven een ondertekende geïnformeerde toestemming voor deze studie, die wordt uitgevoerd na goedkeuring en volgens de richtlijnen van het Helsinki-comité van Carmel Medical Center en het Technion-comité voor toezicht op experimenten bij mensen.

CHEMISCHE ANALYSE VAN DE ADEMMONSTERS:

Gaschromatografie/massaspectrometrie (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, Japan), gecombineerd met een thermisch desorptiesysteem (TD20; Shimadzu Corporation, Japan), wordt gebruikt voor de chemische analyse van de ademmonsters. Een Tenax® TA-adsorbensbuis (Sigma Aldrich Ltd.) wordt gebruikt om de VOC's in de ademmonsters vooraf te concentreren. Met behulp van een op maat gemaakt pompsysteem worden de ademmonsters uit de Mylar-zakken opgezogen door de TA-buis met een stroomsnelheid van 100 ml/min, waarna ze worden overgebracht naar een thermische desorptiebuis (TD) (Sigma Aldrich Ltd.) voordat ze worden geanalyseerd door GC-MS. Het volgende oventemperatuurprofiel werd ingesteld: (a) 10 min bij 35°C; (b) 4°C/min stijging tot 150°C; (c) 10°C/min stijging tot 300°C; en (d) 15 min bij 300°C. Er wordt een SLB-5ms capillaire kolom (Sigma Aldrich Ltd.) met 5% fenylmethylsiloxaan (30 m lengte, 0,25 mm inwendige diameter en 0,5 μm dikte) gebruikt. De splitless injectiemodus wordt gedurende 2 minuten gebruikt, bij een constante lineaire snelheid van 30 cm/sec en een kolomstroom van 0,70 ml/min. De moleculaire structuren van de VOC's worden bepaald via de standaard modulaire set, met 10 ppm isobutyleen (Calgaz, Cambridge, Maryland, VS) als standaard kalibratiegas tijdens elke run. GC-MS-chromatogramanalyse wordt gerealiseerd met behulp van het GCMS-oplossingsversie 2.53SU1 post-run analyseprogramma (Shimadzu Corporation), waarbij gebruik wordt gemaakt van de verbindingenbibliotheek van het National Institute of Standards and Technology (NIST) (Gaithersburg, MD 20899-1070, VS).

SENSING METINGEN:

Bij interactie tussen de ademmonsters en de detector adsorberen de vluchtige organische stoffen in het organische deel van het detectiemateriaal. Het resultaat van deze adsorptie wordt vertaald in een elektrisch signaal (weerstand) dat wordt verzonden naar de macrowereld (bijvoorbeeld van het apparaat) door het (half)geleidende materiaal in dezelfde film. De resultaten worden vervolgens gepresenteerd op het computerscherm.

Een geautomatiseerd systeem bestuurd door een aangepast LabView-programma (National Instruments) wordt gebruikt om de detectiemetingen uit te voeren. De sensoren worden gelijktijdig getest, in dezelfde belichtingskamer, met behulp van een Agilent 34980A multifunctionele schakelaar. Een Stanford Research System SR830 DSP lock-in versterker bestuurd door een IEEE 488-bus wordt gebruikt om het AC-spanningssignaal (0,2 V bij 1 kHz) te leveren en de bijbehorende stroom te meten (<10μA in de bestudeerde apparaten). Deze opstelling maakt het mogelijk om genormaliseerde veranderingen in geleiding te meten van slechts 0,01%. Tijdens de experimenten werd continu sensorweerstand verkregen. Detectie-experimenten werden continu uitgevoerd met behulp van opeenvolgende blootstellingscycli (zie SOI, sectie 2).

GEGEVENSANALYSE:

Voorzien van extractie. Voor VOC-analyse worden drie parameters uit elke sensorrespons gehaald: (i) de genormaliseerde verandering van sensorweerstand in het midden van de blootstelling (S1); (ii) de genormaliseerde verandering van sensorweerstand aan het einde van de blootstelling (S2); en (iii) het gebied onder de responscurve (S3). S1 en S2 worden berekend met betrekking tot de waarde van de sensorweerstand voorafgaand aan de blootstelling. Voor ademanalyse worden twee parameters geëxtraheerd uit elke sensorrespons (hetzij op de controle-VOC, hetzij op elk vrijkomen van ademmonster): (i) de genormaliseerde verandering van sensorweerstand kort na de blootstelling (S4); en (ii) de genormaliseerde verandering van sensorweerstand in het midden van de blootstelling (S5). S4 en S5 worden berekend met betrekking tot de waarde van de sensorweerstand voorafgaand aan de blootstelling. Achteraf wordt op deze parameters een compensatie- en kalibratieproces toegepast om uit sensorresponsen alleen die informatie te behouden die betrekking heeft op hun respons op de VOC's uit de ademmonsters. De gemiddelde waarden van de parameters verkregen over de twee opeenvolgende blootstellingen aan hetzelfde monster worden vervolgens berekend.