Nanotecnología para la Detección de Esclerosis Múltiple Comparada con Enfermedades Autoinmunes y Neurológicas por Muestras Exhaladas

La EM es la enfermedad neurológica crónica más frecuente que afecta a los adultos jóvenes, y suele aparecer entre los 20 y los 40 años. Las mujeres se ven afectadas 3-4 veces más que los hombres. Es una enfermedad multifactorial compleja, con factores genéticos y ambientales subyacentes. Diferentes poblaciones tienen diferente susceptibilidad (Compston y Coles 2008).

La enfermedad se caracteriza por 2 fenotipos principales: curso recurrente-remitente o progresivo. La discapacidad clínica se debe a la destrucción de la mielina del SNC (principalmente oligodendrocitos) debido a 3 procesos (Franklin 2002; Franklin y Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. Inflamación: las células inmunitarias con actividad aberrante invaden el cerebro y la médula espinal y causan la destrucción de la mielina del SNC (un proceso llamado desmielinización y neurodegeneración secundaria: pérdida axonal y neuronal)
2. Neurodegeneración primaria (pérdida axonal y neuronal) - sin inflamación prominente

3. Reparación: los procesos inflamatorios y neurodegenerativos son seguidos por un intento de reparación del SNC; sin embargo, esta reparación parcial e incompleta suele ser la base de los déficits residuales y la discapacidad (Chandran, Hunt et al. 2008).

   • Se considera que la recaída aguda de la EM (presentada como parálisis, pérdida visual, etc.) se debe a una activación inmunitaria aguda aberrante y un proceso inflamatorio en el SNC.
   • La discapacidad crónica acumulativa - se considera que se debe al proceso Neurodegenerativo.

Los procesos de reparación se notan principalmente después de la recaída aguda y la recuperación de la función puede ser espontánea. Sin embargo, en las recaídas graves a veces es necesario un TRATAMIENTO CON ESTEROIDES (Tischner y Reichardt 2007).

A raíz de una mayor comprensión de la enfermedad, se desarrollaron nuevas inmunoterapias (COPAXON / Interferón-beta) en los últimos 10-15 años para el tratamiento a largo plazo. Sin embargo, estos pueden atenuar la enfermedad (reducir el número de recaídas por año) pero no curarla. Además, son beneficiosos en sólo ~40 % de los pacientes con recaídas y remisiones. Actualmente, no hay tratamientos para los pacientes con la enfermedad progresiva, que tienen un aumento gradual de la discapacidad (Murray 2006).

Actualmente no hay biomarcadores disponibles para el diagnóstico y seguimiento de rutina de la EM. IgG oligoclonales en el LCR - que ayudan a confirmar el diagnóstico, requieren un procedimiento invasivo y no se correlacionan con la actividad de la enfermedad ni con la respuesta a la terapia; y la resonancia magnética, que permite monitorear la actividad de la EM y la respuesta al tratamiento, es demasiado costosa para su uso rutinario (Link y Huang 2006; Murray 2006).

El Dr. Hossam Haick del Technion desarrolló una nariz electrónica para el diagnóstico de enfermedades a través de muestras de aliento. Los estudios previos del Dr. Haick han demostrado que una nariz electrónica basada en nanopartículas de oro podría constituir la base de una herramienta de diagnóstico no invasiva y económica para el cáncer de pulmón (Peng, Tisch et al. 2009) y enfermedades renales (Haick, Hakim et al. 2009). ).

Hipótesis de investigación Los biomarcadores de inflamación y/o neurodegeneración y/o reparación del SNC pueden detectarse mediante la "nariz electrónica" en muestras de aliento de personas con EM.

objetivo(s)

Identificación de biomarcadores de:

1. Inflamación del SNC y autoinmunidad del SNC
2. neurodegeneración

3. reparación del SNC

   • que pueden servir como marcadores para: enfermedad (frente a controles), actividad de la enfermedad (predicción del curso agresivo de la enfermedad, predicción de recaída; predicción de EM maligna frente a benigna); respuesta a la terapia (esteroides, inmunoterapias o agentes neuroprotectores).

Esquema del plan de trabajo:

Evaluar algunos grupos clínicamente:

• Pacientes con EM en recaída aguda pre - vs - después de 7, 30 y 90 días de tratamiento con esteroides - para evaluar indicadores del proceso inflamatorio agudo y de los efectos del tratamiento con esteroides.
• Pacientes con EM recidivante frente a pacientes con EM progresiva frente a controles que incluyen individuos sanos y pacientes que padecen enfermedades neurológicas y autoinmunes distintas de la EM, para evaluar los indicadores inflamatorios frente a los neurodegenerativos.
• Pacientes con EM que responden bien o mal a la inmunoterapia o a los esteroides.

COLECCIÓN DE ALIENTO:

El aliento alveolar de los voluntarios se recoge utilizando un método "fuera de línea" que separa eficazmente los biomarcadores volátiles del aliento endógenos de los exógenos y excluye el arrastre nasal. Se recogen dos bolsas de 750 ml de muestras de aliento por voluntario en bolsas Mylar inertes (Eco Medics, Duerten, Suiza). El muestreo de vapor se realizó mediante un muestreo prolongado de la respiración en el aparato de recolección durante 15 a 20 minutos, con varias paradas durante este proceso. Los primeros tres minutos de muestreo de aliento se descartan debido a la posible contaminación del aire respiratorio superior. El aire profundo subsiguiente se retiene con fines de prueba. Las muestras se recogen con un tubo que se introduce en la boca del voluntario y se conecta a la bolsa de recogida. Todos los participantes brindan un consentimiento informado firmado para este estudio, que se realiza después de la aprobación y de acuerdo con las pautas del Comité de Helsinki del Centro Médico Carmel y el comité de Technion para la supervisión de experimentos en humanos.

ANÁLISIS QUÍMICO DE LAS MUESTRAS DE ALIENTO:

La cromatografía de gases/espectrometría de masas (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, Japón), combinada con un sistema de desorción térmica (TD20; Shimadzu Corporation, Japón), se utiliza para el análisis químico de las muestras de aliento. Se emplea un tubo adsorbente Tenax® TA (Sigma Aldrich Ltd.) para preconcentrar los COV en las muestras de aliento. Con un sistema de bomba hecho a medida, las muestras de aliento de las bolsas de Mylar se aspiran a través del tubo TA a un caudal de 100 ml/min y luego se transfieren a un tubo de desorción térmica (TD) (Sigma Aldrich Ltd.) antes de analizarlas. por GC-MS. Se fijó el siguiente perfil de temperatura del horno: (a) 10 min a 35°C; (b) rampa de 4°C/min hasta 150°C; (c) rampa de 10°C/min hasta 300°C; y (d) 15 min a 300°C. Se emplea una columna capilar SLB-5ms (Sigma Aldrich Ltd.) con 5% de fenilmetilsiloxano (30 m de longitud, 0,25 mm de diámetro interno y 0,5 µm de espesor). El modo de inyección splitless se utiliza durante 2 min, a una velocidad lineal constante de 30 cm/seg y un flujo de columna de 0,70 ml/min. Las estructuras moleculares de los COV se determinan a través del conjunto modular estándar, utilizando 10 ppm de isobutileno (Calgaz, Cambridge, Maryland, EE. UU.) como gas de calibración estándar durante cada ejecución. El análisis del cromatograma GC-MS se realiza utilizando el programa de análisis posterior a la ejecución de soluciones GCMS versión 2.53SU1 (Shimadzu Corporation), empleando la biblioteca de compuestos del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) (Gaithersburg, MD 20899-1070, EE. UU.).

MEDIDAS DE DETECCIÓN:

Tras la interacción entre las muestras de aliento y el detector, los compuestos orgánicos volátiles se adsorben en la parte orgánica del material de detección. El resultado de esta adsorción se traduce en una señal eléctrica (resistencia) que se transmite al mundo macro (p. ej., la pantalla). del dispositivo) a través del material (semi-)conductor que se encuentra en la misma película. Luego, los resultados se presentan en la pantalla de la computadora.

Se utiliza un sistema automatizado controlado por un programa personalizado LabView (National Instruments) para realizar las mediciones de detección. Los sensores se prueban simultáneamente, en la misma cámara de exposición, utilizando un interruptor multifunción Agilent 34980A. Se utiliza un amplificador lock-in Stanford Research System SR830 DSP controlado por un bus IEEE 488 para suministrar la señal de voltaje de CA (0,2 V a 1 kHz) y para medir la corriente correspondiente (<10 μA en los dispositivos estudiados). Esta configuración permite medir cambios normalizados en la conductancia tan pequeños como 0,01 %. La resistencia del sensor se adquirió continuamente durante los experimentos. Los experimentos de detección se realizaron continuamente utilizando ciclos de exposición posteriores (ver SOI, sección 2).

ANÁLISIS DE LOS DATOS:

Extracción de características. Para el análisis de VOC, se extraen tres parámetros de cada respuesta del sensor: (i) el cambio normalizado de la resistencia del sensor en el medio de la exposición (S1); (ii) el cambio normalizado de la resistencia del sensor al final de la exposición (S2); y (iii) el área bajo la curva de respuesta (S3). S1 y S2 se calculan con respecto al valor de la resistencia del sensor antes de la exposición. Para el análisis del aliento, se extraen dos parámetros de la respuesta de cada sensor (ya sea al VOC de control o a cada liberación de muestra de aliento): (i) el cambio normalizado de la resistencia de los sensores poco después de la exposición (S4); y (ii) el cambio normalizado de la resistencia de los sensores a la mitad de la exposición (S5). S4 y S5 se calculan con respecto al valor de la resistencia del sensor antes de la exposición. Posteriormente se aplica un proceso de compensación y calibración a estos parámetros para retener de las respuestas del sensor solo la información relacionada con su respuesta a los COV de las muestras de aliento. A continuación, se calculan los valores medios de los parámetros obtenidos en las dos exposiciones sucesivas a la misma muestra.