Nanotechnologia do wykrywania stwardnienia rozsianego w porównaniu z chorobami autoimmunologicznymi i neurologicznymi na podstawie próbek wydychanych

Stwardnienie rozsiane jest najczęstszą przewlekłą chorobą neurologiczną dotykającą młodych dorosłych, rozpoczynającą się zwykle w wieku 20-40 lat. Kobiety chorują 3-4 razy częściej niż mężczyźni. Jest to złożona choroba wieloczynnikowa, u podłoża której leży zarówno czynnik genetyczny, jak i środowiskowy. Różne populacje mają różną podatność (Compston i Coles 2008).

Choroba charakteryzuje się 2 głównymi fenotypami: rzutowo-remisyjnym lub postępującym. Niepełnosprawność kliniczna jest spowodowana zniszczeniem mieliny OUN (głównie oligodendrocytów) w wyniku 3 procesów (Franklin 2002; Franklin i Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow i in. 2009):

1. Zapalenie - komórki odpornościowe o nieprawidłowej aktywności atakują mózg i rdzeń kręgowy i powodują zniszczenie mieliny OUN (proces zwany demielinizacją i wtórną neurodegeneracją - utrata aksonów i neuronów)
2. Pierwotna neurodegeneracja (utrata aksonów i neuronów) – bez wyraźnego stanu zapalnego

3. Naprawa – po procesach zapalnych i neurodegeneracyjnych następuje próba naprawy OUN – jednak ta częściowa i niepełna naprawa jest często podstawą resztkowych deficytów i niesprawności (Chandran, Hunt i in. 2008).

   • Uważa się, że ostry nawrót stwardnienia rozsianego (objawiający się paraliżem, utratą wzroku itp.) jest spowodowany nieprawidłową ostrą aktywacją immunologiczną i procesem zapalnym w OUN.
   • Uważa się, że chroniczna kumulująca się niepełnosprawność jest spowodowana procesem neurodegeneracyjnym.

Procesy naprawcze obserwuje się głównie po ostrym nawrocie – przywrócenie funkcji może nastąpić samoistnie. Jednak w ciężkich nawrotach czasami zachodzi potrzeba LECZENIA STEROIDAMI (Tischner i Reichardt 2007).

Wraz ze wzrostem wiedzy na temat choroby, w ciągu ostatnich 10-15 lat opracowano nowe immunoterapie (COPAXON/; Interferon-beta) do długotrwałego leczenia. Jednak mogą one złagodzić chorobę (zmniejszyć liczbę nawrotów rocznie), ale jej nie wyleczyć. Ponadto są one korzystne tylko u około 40% pacjentów z rzutami i remisjami. Obecnie nie ma terapii dla pacjentów z chorobą postępującą – u których występuje stopniowa narastająca niepełnosprawność (Murray 2006).

Obecnie nie ma dostępnych biomarkerów do diagnozy i rutynowej obserwacji SM. oligoklonalne IgG w płynie mózgowo-rdzeniowym – które pomagają potwierdzić rozpoznanie, wymagają postępowania inwazyjnego i nie są skorelowane z aktywnością choroby ani odpowiedzią na leczenie; i MRI, który umożliwia monitorowanie aktywności stwardnienia rozsianego i odpowiedzi na leczenie jest zbyt kosztowne do rutynowego stosowania (Link i Huang 2006; Murray 2006).

Dr Hossam Haick z Technion opracował elektroniczny nos do diagnozowania chorób za pomocą próbek oddechu. Wcześniejsze badania dr Haicka wykazały, że elektroniczny nos oparty na nanocząstkach złota może stanowić podstawę niedrogiego i nieinwazyjnego narzędzia diagnostycznego raka płuc (Peng, Tisch i in. 2009) oraz chorób nerek (Haick, Hakim i in. 2009). ).

Hipoteza badawcza Biomarkery zapalenia OUN i/lub neurodegeneracji i/lub naprawy OUN można wykryć za pomocą „elektronicznego nosa” w próbkach oddechu osób ze stwardnieniem rozsianym.

Celuje)

Identyfikacja biomarkerów:

1. Zapalenie ośrodkowego układu nerwowego i autoimmunizacja ośrodkowego układu nerwowego
2. Neurodegeneracja

3. naprawa OUN

   • które mogą służyć jako markery dla: choroby (w porównaniu z kontrolą), aktywności choroby (przewidywanie agresywnego przebiegu choroby, przewidywanie nawrotu; przewidywanie złośliwego vs łagodnego stwardnienia rozsianego); odpowiedź na terapię (sterydy, immunoterapie lub środki neuroprotekcyjne).

Zarys planu pracy:

Oceń klinicznie kilka grup:

• Pacjenci z SM w ostrym nawrocie przed - vs- po 7, 30 i 90 dniach leczenia sterydami - w celu oceny wskaźników ostrego procesu zapalnego i efektów leczenia sterydami.
• Pacjenci z rzutową postacią stwardnienia rozsianego vs pacjenci z postępującą postacią stwardnienia rozsianego vs grupa kontrolna, która obejmuje osoby zdrowe, jak również pacjentów cierpiących na choroby neurologiczne i autoimmunologiczne inne niż stwardnienie rozsiane - w celu oceny wskaźników zapalnych i neurodegeneracyjnych.
• Pacjenci ze stwardnieniem rozsianym, którzy dobrze i źle reagują na immunoterapię lub sterydy.

KOLEKCJA ODDECHÓW:

Oddech pęcherzykowy ochotników jest zbierany metodą „offline”, która skutecznie oddziela endogenne od egzogennych biomarkerów lotnych oddechu i wyklucza porywanie przez nos. Dwie torby po 750 ml próbek oddechu na ochotnika są zbierane w obojętnych torebkach Mylar (Eco Medics, Duerten, Szwajcaria). Pobieranie próbek oparów odbywało się poprzez przedłużone pobieranie próbek powietrza do aparatu zbierającego przez 15-20 minut, z kilkoma przerwami w trakcie tego procesu. Pierwsze trzy minuty pobierania próbek oddechu są odrzucane ze względu na możliwe zanieczyszczenie górnych dróg oddechowych. Późniejsze głębokie powietrze jest zatrzymywane do celów testowych. Próbki pobiera się za pomocą rurki, którą wprowadza się do ust ochotnika i łączy z workiem do pobierania. Wszyscy uczestnicy przedstawiają podpisaną świadomą zgodę na to badanie, które jest przeprowadzane po zatwierdzeniu i zgodnie z wytycznymi Komitetu Helsińskiego Centrum Medycznego Carmel i komitetu Technion ds. Nadzoru eksperymentów na ludziach.

ANALIZA CHEMICZNA PRÓBEK ODDECHÓW:

Chromatografia gazowa/spektrometria masowa (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, Japonia) w połączeniu z systemem desorpcji termicznej (TD20; Shimadzu Corporation, Japonia) służy do analizy chemicznej próbek oddechu. Rurka adsorpcyjna Tenax® TA (Sigma Aldrich Ltd.) jest używana do wstępnego zatężania LZO w próbkach wydychanego powietrza. Za pomocą niestandardowego systemu pomp próbki oddechu z worków Mylar są zasysane przez rurkę TA przy przepływie 100 ml/min, a następnie przenoszone do rurki do desorpcji termicznej (TD) (Sigma Aldrich Ltd.) przed analizą przez GC-MS. Ustawiono następujący profil temperatury pieca: (a) 10 min w 35°C; (b) wzrost 4°C/min do 150°C; (c) wzrost temperatury 10°C/min do 300°C; i (d) 15 minut w 300°C. Stosowano kolumnę kapilarną SLB-5ms (Sigma Aldrich Ltd.) z 5% fenylometylosiloksanem (długość 30 m, średnica wewnętrzna 0,25 mm i grubość 0,5 μm). Tryb wstrzykiwania bez podziału stosuje się przez 2 minuty, przy stałej prędkości liniowej 30 cm/sek i przepływie przez kolumnę 0,70 ml/min. Struktury molekularne LZO są określane za pomocą standardowego zestawu modułowego, przy użyciu 10 ppm izobutylenu (Calgaz, Cambridge, Maryland, USA) jako standardowego gazu kalibracyjnego podczas każdego przebiegu. Analizę chromatogramu GC-MS przeprowadza się przy użyciu programu do analizy po przebiegu GCMS Solutions wersja 2.53SU1 (Shimadzu Corporation), wykorzystując bibliotekę związków National Institute of Standards and Technology (NIST) (Gaithersburg, MD 20899-1070, USA).

WYKRYWANIE POMIARÓW:

Podczas interakcji między próbkami oddechu a detektorem lotne związki organiczne adsorbują się w organicznej części materiału detekcyjnego Wynik tej adsorpcji jest przekształcany w sygnał elektryczny (rezystancja), który jest przesyłany do makroświata (np. ekranu urządzenia) przez (pół-)przewodzący materiał znajdujący się w tej samej folii. Wyniki prezentowane są następnie na ekranie komputera.

Do wykonywania pomiarów czujnikowych używany jest zautomatyzowany system kontrolowany przez niestandardowy program LabView (National Instruments). Czujniki są testowane jednocześnie, w tej samej komorze ekspozycyjnej, za pomocą wielofunkcyjnego przełącznika Agilent 34980A. Wzmacniacz typu lock-in Stanford Research System SR830 DSP sterowany magistralą IEEE 488 służy do zasilania sygnału napięciowego AC (0,2 V przy 1 kHz) oraz do pomiaru odpowiedniego prądu (<10 μA w badanych urządzeniach). Ta konfiguracja pozwala na pomiar znormalizowanych zmian przewodnictwa tak małych jak 0,01%. Rezystancję czujnika mierzono w sposób ciągły podczas eksperymentów. Eksperymenty z wykrywaniem były przeprowadzane w sposób ciągły przy użyciu kolejnych cykli ekspozycji (patrz SOI, sekcja 2).

ANALIZA DANYCH:

Ekstrakcja cech. W przypadku analizy LZO z każdej odpowiedzi czujnika wyodrębniane są trzy parametry: (i) znormalizowana zmiana rezystancji czujnika w środku ekspozycji (S1); (ii) znormalizowana zmiana rezystancji czujnika pod koniec ekspozycji (S2); oraz (iii) pole pod krzywą odpowiedzi (S3). S1 i S2 są obliczane na podstawie wartości rezystancji czujnika przed ekspozycją. W przypadku analizy oddechu z każdej odpowiedzi czujnika (albo na kontrolne VOC, albo na każde uwolnienie próbki oddechu) wyodrębniane są dwa parametry: (i) znormalizowana zmiana rezystancji czujników wkrótce po ekspozycji (S4); oraz (ii) znormalizowaną zmianę rezystancji czujników w środku ekspozycji (S5). S4 i S5 są obliczane na podstawie wartości rezystancji czujnika przed ekspozycją. Proces kompensacji i kalibracji jest później stosowany do tych parametrów, aby zachować z odpowiedzi czujnika tylko te informacje, które dotyczą jego odpowiedzi na LZO z próbek oddechu. Następnie oblicza się średnie wartości parametrów uzyskanych w ciągu dwóch kolejnych ekspozycji na tę samą próbkę.