通过呼出样本检测多发性硬化症与自身免疫性疾病和神经系统疾病的纳米技术

MS 是影响年轻人的最常见的慢性神经系统疾病，发病年龄通常在 20-40 岁之间。 女性受影响是男性的 3-4 倍。 它是一种复杂的多因素疾病，具有潜在的遗传和环境因素。 不同的人群具有不同的易感性（Compston 和 Coles 2008）。

该疾病的特征在于 2 种主要表型：复发-缓解型或进行性病程。 临床残疾是由于 CNS 髓磷脂（主要是少突胶质细胞）的破坏导致的 3 个过程（Franklin 2002；Franklin 和 Ffrench-Constant 2008；Frischer、Bramow 等人 2009）：

1. 炎症 - 具有异常活动的免疫细胞侵入大脑和脊髓并导致中枢神经系统髓鞘破坏（称为脱髓鞘和继发性神经变性 - 轴突和神经元损失的过程）
2. 原发性神经变性（轴突和神经元丢失）- 无明显炎症

3. 修复——炎症和神经退行性过程之后是 CNS 修复的尝试——然而，这种部分和不完全的修复通常是残留缺陷和残疾的基础（Chandran，Hunt 等人，2008 年）。

   • 急性 MS 复发（表现为瘫痪、视力丧失等）- 被认为是由于中枢神经系统中异常的急性免疫激活和炎症过程。
   • 慢性累积残疾 - 被认为是由于神经退行性过程。

修复过程主要在急性复发后出现——功能的恢复可以是自发的。 然而，在严重的复发中，有时需要类固醇治疗（Tischner 和 Reichardt 2007）。

随着对该疾病了解的增加，在过去 10-15 年中开发了新的免疫疗法（COPAXON /；干扰素-β）用于长期治疗。 然而，这些可以减轻疾病（减少每年的复发次数）但不能治愈它。 此外，它们仅对约 40% 的复发缓解患者有益。 目前尚无针对患有渐进性疾病（残疾逐渐增加）的患者的治疗方法（Murray 2006）。

目前没有可用于 MS 诊断和常规随访的生物标志物。 CSF 中的寡克隆 IgG——有助于确认诊断，需要侵入性操作，与疾病活动度或治疗反应无​​关；和 MRI，它允许监测 MS 活动和对治疗的反应，但对于常规使用来说过于昂贵（Link 和 Huang 2006；Murray 2006）。

Technion 的 Hossam Haick 博士开发了一种电子鼻，可通过呼吸样本诊断疾病。 Haick 博士之前的研究表明，基于金纳米粒子的电子鼻可以成为一种廉价且非侵入性的肺癌（Peng、Tisch 等人，2009 年）和肾脏疾病（Haick、Hakim 等人，2009 年）诊断工具的基础).

研究假设 CNS 炎症和/或神经变性和/或 CNS 修复的生物标志物可以通过 MS 患者呼吸样本中的“电子鼻”检测到。

目标

鉴定生物标志物：

1. CNS 炎症和 CNS 自身免疫
2. 神经变性

3. 中枢修复

   • 可用作以下指标：疾病（与对照相比）、疾病活动（预测侵袭性病程、预测复发；预测恶性 MS 与良性 MS）；对治疗的反应（类固醇、免疫疗法或神经保护剂）。

工作计划大纲：

临床评估几组：

• MS 患者在类固醇治疗 7、30 和 90 天前与急性复发后对比 - 以评估急性炎症过程和类固醇治疗效果的指标。
• 复发性 MS 患者与进行性 MS 患者与对照组（包括健康个体以及患有 MS 以外的神经和自身免疫性疾病的患者）对比，以评估炎症与神经退行性指标。
• 对免疫疗法或类固醇反应良好与不良反应的 MS 患者。

呼吸收集：

使用“离线”方法收集志愿者的肺泡呼吸，该方法有效地将内源性和外源性呼吸挥发性生物标志物分开，并排除鼻夹带。 将每位志愿者两袋 750 毫升的呼吸样本收集在惰性聚酯薄膜袋（Eco Medics，Duerten，Switzerland）中。 蒸汽采样是通过将呼吸采样延长到收集装置中进行 15-20 分钟，在此过程中有几次停止。 由于上呼吸道空气可能受到污染，前三分钟的呼吸采样被丢弃。 随后的深层空气被保留用于测试目的。 样品是用一根管子收集的，该管子插入志愿者的嘴里并连接到收集袋。 所有参与者都签署了对本研究的知情同意书，该研究是在获得批准并根据卡梅尔医学中心赫尔辛基委员会和 Technion 人类实验监督委员会的指导方针进行的。

呼吸样本的化学分析：

气相色谱/质谱法（GCMS-QP2010；日本岛津公司）结合热解吸系统（TD20；日本岛津公司）用于呼吸样本的化学分析。 Tenax® TA 吸附管（Sigma Aldrich Ltd.）用于预浓缩呼吸样本中的 VOC。 使用定制的泵系统，从 Mylar 袋中吸入的呼吸样本以 100 毫升/分钟的流速通过 TA 管吸入，然后在分析之前转移到热解吸 (TD) 管（Sigma Aldrich Ltd.）通过 GC-MS。 设置以下烘箱温度曲线：(a) 35°C 10 分钟； (b) 4°C/min 升温至 150°C； (c) 10°C/min 升温至 300°C； (d) 在 300°C 下 15 分钟。 使用具有 5% 苯基甲基硅氧烷（30 m 长、0.25 mm 内径和 0.5 μm 厚度）的 SLB-5ms 毛细管柱（Sigma Aldrich Ltd.）。 不分流注射模式用于 2 分钟，以 30 厘米/秒的恒定线速度和 0.70 毫升/分钟的柱流量。 VOC 的分子结构通过标准模块组确定，在每次运行期间使用 10 ppm 异丁烯（Calgaz，剑桥，美国马里兰州）作为标准校准气体。 GC-MS 色谱分析是使用 GCMS 解决方案版本 2.53SU1 运行后分析程序（Shimadzu Corporation）实现的，采用美国国家标准与技术研究院（NIST）化合物库（Gaithersburg，MD 20899-1070，USA）。

传感测量：

在呼吸样本和检测器之间相互作用时，挥发性有机化合物吸附到传感材料的有机部分。这种吸附的结果转化为电信号（电阻），传输到宏观世界（例如，屏幕设备的）通过在同一薄膜中发现的（半）导电材料。 然后将结果显示在计算机屏幕上。

由自定义 LabView (National Instruments) 程序控制的自动化系统用于执行传感测量。 使用 Agilent 34980A 多功能开关在同一曝光室中同时测试传感器。 由 IEEE 488 总线控制的斯坦福研究系统 SR830 DSP 锁相放大器用于提供交流电压信号（1 kHz 时为 0.2 V）并测量相应的电流（在所研究的设备中 <10μA）。 此设置允许测量小至 0.01% 的电导标准化变化。 在实验过程中不断获取传感器电阻。 使用后续曝光周期连续进行传感实验（参见 SOI，第 2 节）。

数据分析：

特征提取。 对于 VOC 分析，从每个传感器响应中提取三个参数：(i) 曝光中间传感器电阻的归一化变化 (S1)； (ii) 曝光结束时传感器电阻的归一化变化 (S2)； (iii) 响应曲线下的面积 (S3)。 S1 和 S2 是根据曝光前的传感器电阻值计算的。 对于呼吸分析，从每个传感器响应（对控制 VOC 或对每次释放的呼吸样本）中提取两个参数：（i）暴露后不久传感器电阻的归一化变化（S4）； (ii) 曝光中间传感器电阻的归一化变化 (S5)。 S4 和 S5 是根据曝光前的传感器电阻值计算的。 补偿和校准过程随后应用于这些参数，以从传感器响应中仅保留与它们对来自呼吸样本的 VOC 的响应相关的信息。 然后计算在同一样本的两次连续曝光中获得的参数的平均值。