Nanotecnologia para Detecção de Esclerose Múltipla Comparada a Doenças Autoimunes e Neurológicas por Amostras Exaladas

A EM é a doença neurológica crônica mais comum que afeta adultos jovens, com início geralmente na idade de 20 a 40 anos. As mulheres são afetadas 3-4 vezes mais do que os homens. É uma doença multifatorial complexa, com fatores genéticos e ambientais subjacentes. Populações diferentes têm suscetibilidade diferente (Compston e Coles 2008).

A doença é caracterizada por 2 fenótipos principais: remitente-recorrente ou curso progressivo. A incapacidade clínica é devida à destruição da mielina do SNC (principalmente oligodendrócitos) devido a 3 processos (Franklin 2002; Franklin e Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. Inflamação - células imunes com atividade aberrante invadem o cérebro e a medula espinhal e causam destruição da mielina do SNC (um processo chamado desmielinização e neurodegeneração secundária - perda axonal e neuronal)
2. Neurodegeneração primária (perda axonal e neuronal) - sem inflamação proeminente

3. Reparação - os processos inflamatórios e neurodegenerativos são seguidos por uma tentativa de reparação do SNC - no entanto, esta reparação parcial e incompleta é muitas vezes a base de défices residuais e incapacidade (Chandran, Hunt et al. 2008).

   • A recaída aguda da EM (apresentada como paralisia, perda visual, etc.) - é considerada devida a uma ativação imune aguda aberrante e processo inflamatório no SNC.
   • A deficiência crônica acumulativa - é considerada decorrente do processo neurodegenerativo.

Os processos de reparo são observados principalmente após a recaída aguda - e a recuperação da função pode ser espontânea. No entanto, em recaídas graves, às vezes há necessidade de TRATAMENTO COM ESTERÓIDES (Tischner e Reichardt 2007).

Após o aumento da compreensão da doença, novas imunoterapias foram desenvolvidas (COPAXON /; Interferon-beta) nos últimos 10-15 anos para tratamento de longo prazo. No entanto, estes podem atenuar a doença (reduzir o número de recaídas por ano), mas não a curam. Além disso, eles são benéficos em apenas ~40% dos pacientes remitentes-recorrentes. Atualmente não há tratamentos para pacientes com a doença progressiva - que têm aumento gradual da incapacidade (Murray 2006).

Atualmente não há biomarcadores disponíveis para diagnóstico e acompanhamento de rotina da EM. IgG oligoclonal no LCR - que auxiliam na confirmação do diagnóstico, requerem procedimento invasivo e não se correlacionam com a atividade da doença nem com a resposta à terapia; e a ressonância magnética, que permite monitorar a atividade da EM e a resposta ao tratamento, é muito cara para uso rotineiro (Link e Huang 2006; Murray 2006).

O Dr. Hossam Haick, do Technion, desenvolveu um nariz eletrônico para diagnóstico de doenças por meio de amostras de respiração. Os estudos anteriores do Dr. Haick mostraram que um nariz eletrônico baseado em nanopartículas de ouro poderia formar a base de uma ferramenta de diagnóstico não invasiva e barata para câncer de pulmão (Peng, Tisch et al. 2009) e doenças renais (Haick, Hakim et al. 2009). ).

Hipótese de pesquisa Biomarcadores de inflamação do SNC e/ou neurodegeneração e/ou reparo do SNC podem ser detectados pelo "nariz eletrônico" em amostras de respiração de pessoas com EM.

Mira)

Identificação de biomarcadores de:

1. Inflamação do SNC e autoimunidade do SNC
2. neurodegeneração

3. reparação do SNC

   • que podem servir como marcadores para: doença (vs controles), atividade da doença (prevendo o curso agressivo da doença, predizendo a recaída; predizendo a EM maligna vs benigna); resposta à terapia (esteróides, imunoterapias ou agentes neuroprotetores).

Esboço do plano de trabalho:

Avalie alguns grupos clinicamente:

• Pacientes com EM em recaída aguda pré-vs- após 7,30 e 90 dias de tratamento com esteróides - para avaliar indicadores do processo inflamatório agudo e dos efeitos do tratamento com esteróides.
• Pacientes com EM recidivante versus pacientes com EM progressiva versus controles que incluem indivíduos saudáveis, bem como pacientes que sofrem de doenças neurológicas e autoimunes além da EM - para avaliar indicadores inflamatórios versus neurodegenerativos.
• Pacientes com EM que respondem bem ou mal a imunoterapia ou esteroides.

COLETA DE RESPIRAÇÃO:

A respiração alveolar dos voluntários é coletada usando um método "offline" que efetivamente separa os biomarcadores voláteis endógenos dos exógenos e exclui o arrastamento nasal. Dois sacos de 750 ml de amostras de respiração por voluntário são coletados em sacos Mylar inertes (Eco Medics, Duerten, Suíça). A amostragem de vapor foi realizada por amostragem de respiração prolongada no aparelho de coleta por 15 a 20 minutos, com várias paradas durante esse processo. Os primeiros três minutos de amostragem da respiração são descartados devido à possível contaminação do ar respiratório superior. O ar profundo subseqüente é retido para fins de teste. As amostras são coletadas com um tubo que foi introduzido na boca do voluntário e conectado à bolsa coletora. Todos os participantes forneceram um consentimento informado assinado para este estudo, que é realizado após a aprovação e de acordo com as diretrizes do Comitê de Helsinki do Carmel Medical Center e do comitê do Technion para supervisão de experimentos em humanos.

ANÁLISE QUÍMICA DAS AMOSTRAS DE RESPIRAÇÃO:

A cromatografia gasosa/espectrometria de massa (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, Japão), combinada com um sistema de dessorção térmica (TD20; Shimadzu Corporation, Japão), é usada para a análise química das amostras respiratórias. Um tubo adsorvente Tenax® TA (Sigma Aldrich Ltd.) é empregado para pré-concentrar os VOCs nas amostras de respiração. Usando um sistema de bomba feito sob medida, as amostras de respiração das bolsas de Mylar são sugadas pelo tubo TA a uma taxa de fluxo de 100 ml/min, sendo então transferidas para um tubo de dessorção térmica (TD) (Sigma Aldrich Ltd.) antes de serem analisadas por GC-MS. O seguinte perfil de temperatura do forno foi definido: (a) 10 min a 35°C; (b) rampa de 4°C/min até 150°C; (c) rampa de 10°C/min até 300°C; e (d) 15 min a 300°C. Uma coluna capilar SLB-5ms (Sigma Aldrich Ltd.) com 5% de fenil metil siloxano (30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,5 μm de espessura) é empregada. O modo de injeção splitless é usado por 2 min, a 30 cm/s de velocidade linear constante e fluxo de coluna de 0,70 ml/min. As estruturas moleculares dos VOCs são determinadas por meio do conjunto modular padrão, usando 10 ppm de isobutileno (Calgaz, Cambridge, Maryland, EUA) como gás de calibração padrão durante cada execução. A análise de cromatograma GC-MS é realizada usando o programa de análise pós-execução de soluções GCMS versão 2.53SU1 (Shimadzu Corporation), empregando a biblioteca de compostos do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) (Gaithersburg, MD 20899-1070, EUA).

MEDIDAS DE SENSAÇÃO:

Após a interação entre as amostras de respiração e o detector, os compostos orgânicos voláteis adsorvem na parte orgânica do material sensor O resultado dessa adsorção é traduzido em um sinal elétrico (resistência) que é transmitido ao mundo macro (por exemplo, a tela do dispositivo) através do material (semi-)condutor encontrado no mesmo filme. Os resultados são então apresentados na tela do computador.

Um sistema automatizado controlado por um programa personalizado LabView (National Instruments) é usado para realizar as medições de detecção. Os sensores são testados simultaneamente, na mesma câmara de exposição, usando uma chave multifuncional Agilent 34980A. Um amplificador lock-in Stanford Research System SR830 DSP controlado por um barramento IEEE 488 é usado para fornecer o sinal de tensão AC (0,2 V a 1 kHz) e para medir a corrente correspondente (<10μA nos dispositivos estudados). Essa configuração permite medir alterações normalizadas na condutância tão pequenas quanto 0,01%. A resistência do sensor foi continuamente adquirida durante os experimentos. Os experimentos de detecção foram realizados continuamente usando ciclos de exposição subsequentes (consulte SOI, seção 2).

ANÁLISE DE DADOS:

Extração de recursos. Para análise de VOC, três parâmetros são extraídos de cada resposta do sensor: (i) a mudança normalizada da resistência do sensor no meio da exposição (S1); (ii) a variação normalizada da resistência do sensor ao final da exposição (S2); e (iii) a área sob a curva de resposta (S3). S1 e S2 são calculados em relação ao valor da resistência do sensor antes da exposição. Para análise da respiração, dois parâmetros são extraídos de cada resposta do sensor (seja para o VOC de controle ou para cada liberação de amostra de respiração): (i) a mudança normalizada da resistência dos sensores logo após a exposição (S4); e (ii) a variação normalizada da resistência dos sensores no meio da exposição (S5). S4 e S5 são calculados em relação ao valor da resistência do sensor antes da exposição. Um processo de compensação e calibração é aplicado posteriormente a esses parâmetros para reter das respostas do sensor apenas as informações relacionadas à sua resposta aos VOCs das amostras de respiração. São então calculados os valores médios dos parâmetros obtidos nas duas exposições sucessivas à mesma amostra.