Nanoteknologi for påvisning av multippel sklerose sammenlignet med autoimmune og nevrologiske sykdommer ved utåndede prøver

MS er den vanligste kroniske nevrologiske sykdommen som rammer unge voksne, og debuterer vanligvis i alderen 20-40 år. Kvinner rammes 3-4 ganger mer enn menn. Det er en kompleks multifaktoriell sykdom, med underliggende både genetiske og miljømessige faktorer. Ulike populasjoner har ulik mottakelighet (Compston og Coles 2008).

Sykdommen er preget av 2 hovedfenotyper: relapsing-remitting eller progressive kurs. Klinisk funksjonshemming skyldes ødeleggelse av CNS myelin (hovedsakelig oligodendrocytter) på grunn av 3 prosesser (Franklin 2002; Franklin og Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. Betennelse - immunceller med avvikende aktivitet invaderer hjernen og ryggmargen og forårsaker ødeleggelse av CNS myelin (en prosess kalt demyelinisering og sekundær nevrodegenerasjon - aksonalt og nevronalt tap)
2. Primær nevrodegenerasjon (aksonalt og nevronalt tap) - uten fremtredende betennelse

3. Reparasjon - de inflammatoriske og nevrodegenerative prosessene følges av et forsøk fra CNS på å reparere - men denne delvise og ufullstendige reparasjonen er ofte grunnlaget for gjenværende mangler og funksjonshemming (Chandran, Hunt et al. 2008).

   • Det akutte MS-tilbakefallet (presentert som lammelse, synstap, etc.) - anses å skyldes en avvikende akutt immunaktivering og inflammatorisk prosess i CNS.
   • Den kronisk akkumulerende funksjonshemmingen - anses å skyldes den nevrodegenerative prosessen.

Reparasjonsprosesser er hovedsakelig notert etter det akutte tilbakefallet - og gjenoppretting av funksjon kan være spontan. Men ved alvorlige tilbakefall er det noen ganger behov for STEROIDBEHANDLING (Tischner og Reichardt 2007).

Etter økt forståelse av sykdommen ble det utviklet nye immunterapier (COPAXON /; Interferon -beta ) i løpet av de siste 10-15 årene for langtidsbehandling. Disse kan imidlertid dempe sykdommen (redusere antall tilbakefall per år), men kurerer den ikke. I tillegg er de gunstige hos bare ~40 % av pasientene med tilbakefall. For tiden finnes det ingen behandlinger for pasienter med den progressive sykdommen - som har gradvis økt funksjonshemming (Murray 2006).

For tiden er det ingen tilgjengelige biomarkører for diagnose og rutinemessig oppfølging av MS. Oligoklonal IgG i CSF - som bidrar til å bekrefte diagnosen, krever en invasiv prosedyre og er ikke korrelert med sykdomsaktivitet eller respons på terapi; og MR, som tillater overvåking av MS-aktivitet og respons på behandling er for dyrt til rutinemessig bruk (Link og Huang 2006; Murray 2006).

Dr Hossam Haick fra Technion utviklet en elektronisk nese for diagnostisering av sykdommer via pusteprøver. Dr Haicks tidligere studier har vist at en elektronisk nese basert på gullnanopartikler kan danne grunnlaget for et billig og ikke-invasivt diagnostisk verktøy for lungekreft (Peng, Tisch et al. 2009) og nyresykdommer (Haick, Hakim et al. 2009) ).

Forskningshypotese Biomarkører for CNS-betennelse og/eller nevrodegenerasjon og/eller CNS-reparasjon kan påvises av den "elektroniske nesen" i pusteprøver av personer med MS.

Mål

Identifikasjon av biomarkører for:

1. CNS-betennelse og CNS-autoimmunitet
2. Nevrodegenerasjon

3. CNS reparasjon

   • som kan tjene som markører for: sykdom (mot kontroller), sykdomsaktivitet (forutsi aggressivt sykdomsforløp, forutsi tilbakefall; forutsi ondartet vs godartet MS); respons på terapi (steroider, immunterapier eller nevrobeskyttende midler).

Oversikt over arbeidsplan:

Vurder noen få grupper klinisk:

• MS-pasienter ved akutt tilbakefall før - vs- etter 7 , 30 og 90 dagers steroidbehandling - for å vurdere indikatorer på den akutte inflammatoriske prosessen og på effekten av steroidbehandling.
• Residiverende MS-pasienter vs progressive MS-pasienter vs kontroller som inkluderer friske individer så vel som pasienter som lider av andre nevrologiske og autoimmune sykdommer enn MS - for å vurdere inflammatoriske vs nevrodegenerative indikatorer.
• MS-pasienter som er gode vs dårlige - respondere på immunterapi eller steroider.

PUSTESAMLING:

Alveolært pust fra de frivillige samles inn ved hjelp av en "offline"-metode som effektivt skiller de endogene fra de eksogene pusten flyktige biomarkørene og utelukker nesemedriving. To poser med 750 ml pusteprøver per frivillig samles i inerte Mylar-poser (Eco Medics, Duerten, Sveits). Dampprøvetaking ble utført ved utvidet pusteprøvetaking inn i oppsamlingsapparatet i 15-20 minutter, med flere stopp under denne prosessen. De første tre minuttene av pusteprøven blir forkastet på grunn av mulig kontaminering av øvre luftveier. Den påfølgende dype luften beholdes for testformål. Prøvene tas med et rør som ble ført i munnen til den frivillige og koblet til oppsamlingsposen. Alle deltakere gir et signert informert samtykke til denne studien, som utføres etter godkjenning og i henhold til retningslinjene fra Helsinki-komiteen ved Carmel Medical Center og Technions komité for tilsyn med eksperimenter på mennesker.

KJEMISK ANALYSE AV PUSTEPRØVENE:

Gasskromatografi/massespektrometri (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, Japan), kombinert med et termisk desorpsjonssystem (TD20; Shimadzu Corporation, Japan), brukes til kjemisk analyse av pusteprøvene. Et Tenax® TA adsorbentrør (Sigma Aldrich Ltd.) brukes for å forhåndskonsentrere VOC i pusteprøvene. Ved hjelp av et spesiallaget pumpesystem suges pusteprøvene fra Mylar-posene opp gjennom TA-røret med 100 ml/min strømningshastighet, og overføres deretter til et termisk desorpsjonsrør (TD) (Sigma Aldrich Ltd.) før de analyseres av GC-MS. Følgende ovnstemperaturprofil ble satt: (a) 10 minutter ved 35°C; (b) 4°C/min rampe til 150°C; (c) 10°C/min rampe til 300°C; og (d) 15 minutter ved 300°C. En SLB-5ms kapillærkolonne (Sigma Aldrich Ltd.) med 5 % fenylmetylsiloksan (30 m lengde, 0,25 mm indre diameter og 0,5 μm tykkelse) brukes. Den splittløse injeksjonsmodusen brukes i 2 minutter, ved 30 cm/sek. konstant lineær hastighet og 0,70 ml/min kolonnestrøm. De molekylære strukturene til VOC-ene bestemmes via standard modulære sett, ved å bruke 10 ppm isobutylen (Calgaz, Cambridge, Maryland, USA) som standard kalibreringsgass under hver kjøring. GC-MS kromatogramanalyse er realisert ved å bruke GCMS-løsninger versjon 2.53SU1 etter-kjørt analyseprogram (Shimadzu Corporation), ved bruk av National Institute of Standards and Technology (NIST)-forbindelsesbiblioteket (Gaithersburg, MD 20899-1070, USA).

SENSEMÅL:

Ved interaksjon mellom pusteprøvene og detektoren, adsorberer de flyktige organiske forbindelsene inn i den organiske delen av sensormaterialet. Resultatet av denne adsorpsjonen blir oversatt til et elektrisk signal (motstand) som overføres til makroverdenen (f.eks. skjermen) av enheten) gjennom det (halv-)ledende materialet som finnes i den samme filmen. Resultatene presenteres deretter på datamaskinens skjerm.

Et automatisert system kontrollert av et tilpasset LabView (National Instruments)-program brukes til å utføre sansemålingene. Sensorene testes samtidig, i samme eksponeringskammer, ved hjelp av en Agilent 34980A multifunksjonsbryter. En Stanford Research System SR830 DSP låseforsterker kontrollert av en IEEE 488-buss brukes til å levere AC-spenningssignalet (0,2 V ved 1 kHz) og for å måle den tilsvarende strømmen (<10μA i de studerte enhetene). Dette oppsettet gjør det mulig å måle normaliserte endringer i konduktans så små som 0,01 %. Sensormotstand ble kontinuerlig oppnådd under eksperimentene. Senseeksperimenter ble kontinuerlig utført ved bruk av påfølgende eksponeringssykluser (se SOI, avsnitt 2).

DATAANALYSE:

Har ekstraksjon. For VOC-analyse trekkes tre parametere ut fra hver sensorrespons: (i) den normaliserte endringen av sensormotstanden i midten av eksponeringen (S1); (ii) den normaliserte endringen av sensormotstanden ved slutten av eksponeringen (S2); og (iii) arealet under responskurven (S3). S1 og S2 beregnes med hensyn til verdien av sensormotstanden før eksponeringen. For pustanalyse ekstraheres to parametere fra hver sensorrespons (enten til kontroll VOC eller til hver utgivelse av pusteprøve): (i) den normaliserte endringen av sensormotstanden like etter eksponeringen (S4); og (ii) den normaliserte endringen av sensormotstanden i midten av eksponeringen (S5). S4 og S5 beregnes med hensyn til verdien av sensormotstanden før eksponeringen. En kompensasjons- og kalibreringsprosess påføres i etterkant av disse parameterne for å beholde fra sensorresponser kun den informasjonen relatert til deres respons på VOC fra pusteprøvene. Deretter beregnes gjennomsnittsverdiene for parameterne oppnådd over de to suksessive eksponeringene for samme prøve.