Нанотехнология для выявления рассеянного склероза по сравнению с аутоиммунными и неврологическими заболеваниями по образцам выдыхаемого воздуха

Рассеянный склероз — наиболее распространенное хроническое неврологическое заболевание, поражающее молодых людей, обычно дебютирующее в возрасте 20–40 лет. Женщины болеют в 3-4 раза чаще, чем мужчины. Это сложное многофакторное заболевание, в основе которого лежат как генетические факторы, так и факторы окружающей среды. Различные популяции имеют разную восприимчивость (Compston and Coles, 2008).

Заболевание характеризуется 2 основными фенотипами: рецидивирующе-ремиттирующее или прогрессирующее течение. Клиническая нетрудоспособность связана с разрушением миелина ЦНС (в основном олигодендроцитов) вследствие 3 процессов (Franklin 2002; Franklin and Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. Воспаление — иммунные клетки с аберрантной активностью проникают в головной и спинной мозг и вызывают разрушение миелина ЦНС (процесс, называемый демиелинизацией и вторичной нейродегенерацией — потерей аксонов и нейронов).
2. Первичная нейродегенерация (гибель аксонов и нейронов) - без выраженного воспаления

3. Репарация — воспалительные и нейродегенеративные процессы сопровождаются попыткой восстановления ЦНС — однако это частичное и неполное восстановление часто является причиной остаточных нарушений и инвалидности (Chandran, Hunt et al. 2008).

   • Острый рецидив рассеянного склероза (проявляющийся параличом, потерей зрения и др.) считается следствием аберрантной острой иммунной активации и воспалительного процесса в ЦНС.
   • Хроническая накапливающаяся инвалидность – считается следствием нейродегенеративного процесса.

Репарационные процессы в основном отмечаются после острого рецидива - и восстановление функции может быть спонтанным. Однако при тяжелых рецидивах иногда требуется ЛЕЧЕНИЕ СТЕРОИДАМИ (Tischner and Reichardt, 2007).

Вслед за возросшим пониманием болезни за последние 10-15 лет были разработаны новые иммунотерапевтические препараты (КОПАКСОН / интерферон-бета) для длительного лечения. Однако они могут ослабить болезнь (уменьшить количество рецидивов в год), но не вылечить ее. Кроме того, они эффективны только у ~40% пациентов с ремиттирующим течением. В настоящее время не существует лечения пациентов с прогрессирующим заболеванием, у которых постепенно нарастает инвалидность (Murray 2006).

В настоящее время нет доступных биомаркеров для диагностики и рутинного наблюдения за рассеянным склерозом. Олигоклональные IgG в спинномозговой жидкости – помогают подтвердить диагноз, требуют инвазивной процедуры и не коррелируют ни с активностью заболевания, ни с реакцией на терапию; и МРТ, которая позволяет контролировать активность рассеянного склероза и реакцию на лечение, слишком дорога для рутинного использования (Link and Huang 2006; Murray 2006).

Доктор Хоссам Хейк из Техниона разработал электронный нос для диагностики заболеваний по образцам дыхания. Предыдущие исследования доктора Хайка показали, что электронный нос на основе наночастиц золота может стать основой недорогого и неинвазивного диагностического инструмента для рака легких (Peng, Tisch et al., 2009) и заболеваний почек (Haick, Hakim et al., 2009). ).

Гипотеза исследования. Биомаркеры воспаления ЦНС и/или нейродегенерации и/или восстановления ЦНС могут быть обнаружены с помощью «электронного носа» в образцах дыхания людей с РС.

Цель(и)

Идентификация биомаркеров:

1. Воспаление ЦНС и ЦНС-аутоиммунитет
2. нейродегенерация

3. ремонт ЦНС

   • которые могут служить маркерами: заболевания (по сравнению с контролем), активности заболевания (прогнозирование агрессивного течения заболевания, прогнозирование рецидива, прогнозирование злокачественного и доброкачественного рассеянного склероза); ответ на терапию (стероиды, иммунотерапия или нейропротекторы).

План работы:

Клинически оцените несколько групп:

• Пациенты с РС при остром рецидиве до и после 7, 30 и 90 дней лечения стероидами - для оценки показателей острого воспалительного процесса и эффектов лечения стероидами.
• Пациенты с рецидивирующим РС, пациенты с прогрессирующим РС и контрольная группа, в которую входят здоровые люди, а также пациенты, страдающие неврологическими и аутоиммунными заболеваниями, отличными от РС, для оценки воспалительных и нейродегенеративных показателей.
• Пациенты с рассеянным склерозом, хорошо или плохо реагирующие на иммунотерапию или стероиды.

СБОР ДЫХАНИЯ:

Альвеолярное дыхание добровольцев собирают с использованием «автономного» метода, который эффективно отделяет эндогенные летучие биомаркеры от экзогенных биомаркеров дыхания и исключает назальный захват. Два пакета по 750 мл образцов дыхания каждого добровольца собирают в инертные пакеты из майлара (Eco Medics, Duerten, Швейцария). Отбор проб паров производился путем продолжительного отбора проб дыхания в аппарат для сбора в течение 15-20 минут с несколькими остановками во время этого процесса. Первые три минуты отбора проб дыхания отбрасываются из-за возможного загрязнения воздуха верхних дыхательных путей. Последующий глубокий воздух сохраняется для целей тестирования. Образцы собирают с помощью трубки, которую вводят в рот добровольца и соединяют с сумкой для сбора. Все участники дают подписанное информированное согласие на это исследование, которое проводится после одобрения и в соответствии с рекомендациями Хельсинкского комитета Медицинского центра Кармель и комитета Техниона по надзору за экспериментами на людях.

ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОБ ДЫХАНИЯ:

Газохроматография/масс-спектрометрия (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, Япония) в сочетании с системой термодесорбции (TD20; Shimadzu Corporation, Япония) используется для химического анализа образцов дыхания. Трубка с адсорбентом Tenax® TA (Sigma Aldrich Ltd.) используется для предварительного концентрирования ЛОС в пробах выдыхаемого воздуха. Используя специально изготовленную насосную систему, пробы дыхания из майларового мешка всасываются через трубку ТА со скоростью потока 100 мл/мин, а затем передаются в трубку для термодесорбции (ТД) (Sigma Aldrich Ltd.) перед анализом. методом ГХ-МС. Был установлен следующий температурный профиль печи: (а) 10 мин при 35°С; (b) 4°C/мин до 150°C; (c) 10°C/мин до 300°C; г) 15 мин при 300°С. Использовали капиллярную колонку SLB-5ms (Sigma Aldrich Ltd.) с 5% фенилметилсилоксана (длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм и толщина 0,5 мкм). Режим ввода без разделения используется в течение 2 мин при постоянной линейной скорости 30 см/с и потоке через колонку 0,70 мл/мин. Молекулярные структуры ЛОС определяются с помощью стандартного модульного набора с использованием изобутилена с концентрацией 10 частей на миллион (Калгаз, Кембридж, Мэриленд, США) в качестве стандартного калибровочного газа во время каждого анализа. Анализ хроматограммы ГХ-МС осуществляется с использованием программы послециклового анализа GCMS Solutions версии 2.53SU1 (Shimadzu Corporation) с использованием библиотеки соединений Национального института стандартов и технологий (NIST) (Gaithersburg, MD 20899-1070, США).

ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ:

При взаимодействии между образцами дыхания и детектором летучие органические соединения адсорбируются органической частью чувствительного материала. Результат этой адсорбции преобразуется в электрический сигнал (сопротивление), который передается в макромир (например, на экран). устройства) через (полу)проводящий материал, находящийся в той же пленке. Затем результаты выводятся на экран компьютера.

Автоматизированная система, управляемая пользовательской программой LabView (National Instruments), используется для выполнения измерительных измерений. Датчики тестируются одновременно в одной и той же камере экспонирования с использованием многофункционального переключателя Agilent 34980A. Блок-усилитель Stanford Research System SR830 DSP, управляемый шиной IEEE 488, используется для подачи сигнала переменного напряжения (0,2 В на частоте 1 кГц) и измерения соответствующего тока (<10 мкА в исследуемых устройствах). Эта установка позволяет измерять нормализованные изменения проводимости с точностью до 0,01%. Сопротивление датчика непрерывно измерялось в ходе экспериментов. Эксперименты по зондированию проводились непрерывно с использованием последующих циклов воздействия (см. SOI, раздел 2).

АНАЛИЗ ДАННЫХ:

Извлечение признаков. Для анализа ЛОС из каждого отклика датчика извлекаются три параметра: (i) нормализованное изменение сопротивления датчика в середине экспозиции (S1); (ii) нормированное изменение сопротивления датчика в конце экспозиции (S2); и (iii) площадь под кривой отклика (S3). S1 и S2 рассчитываются с учетом значения сопротивления датчика до воздействия. Для анализа дыхания два параметра извлекаются из каждого отклика датчика (либо на контрольные ЛОС, либо на каждый выпуск образца дыхания): (i) нормализованное изменение сопротивления датчиков вскоре после воздействия (S4); и (ii) нормированное изменение сопротивления датчиков в середине экспозиции (S5). S4 и S5 рассчитываются с учетом значения сопротивления датчика до воздействия. Затем к этим параметрам применяется процесс компенсации и калибровки, чтобы сохранить из ответов датчиков только ту информацию, которая относится к их реакции на ЛОС из образцов дыхания. Затем рассчитывают средние значения параметров, полученные при двух последовательных экспозициях одного и того же образца.