呼気サンプルによる自己免疫疾患および神経疾患と比較した多発性硬化症の検出のためのナノテクノロジー

MS は若年成人に影響を与える最も一般的な慢性神経疾患であり、通常 20 ～ 40 歳で発症します。 女性は男性の 3 ～ 4 倍の影響を受けます。 これは、遺伝的要因と環境的要因の両方が根底にある複雑な多因子疾患です。 集団が異なれば、感受性も異なります (Compston and Coles 2008)。

この疾患は、再発寛解または進行性の 2 つの主な表現型によって特徴付けられます。 臨床的障害は、3 つのプロセスによる CNS ミエリン (主にオリゴデンドロ サイト) の破壊によるものです (Franklin 2002; Franklin and Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. 炎症 - 異常な活動を伴う免疫細胞が脳と脊髄に侵入し、CNS ミエリンの破壊を引き起こします (脱髄と二次神経変性 - 軸索と神経細胞の喪失と呼ばれるプロセス)。
2. 原発性神経変性 (軸索および神経細胞の喪失) - 顕著な炎症を伴わない

3. 修復 - 炎症および神経変性プロセスに続いて、CNS による修復の試みが行われますが、この部分的で不完全な修復は、多くの場合、後遺症や障害の原因となります (Chandran, Hunt et al. 2008) .

   • 急性 MS の再発 (麻痺、視覚障害などとして現れる) は、CNS における異常な急性免疫活性化および炎症プロセスが原因であると考えられています。
   • 慢性的に蓄積する障害は、神経変性プロセスによるものと考えられています。

修復プロセスは主に急性再発後に認められ、機能の回復は自然発生する可能性があります。 しかし、重度の再発では、ステロイド治療が必要になることがあります (Tischner and Reichardt 2007)。

この病気の理解が深まるにつれて、長期治療のための新しい免疫療法が開発されました (COPAXON /; インターフェロン -ベータ)。 ただし、これらは病気を弱めることができます（年間の再発数を減らす）が、それを治すことはできません. さらに、再発・寛解患者の約 40% にのみ有効です。 現在、進行性疾患の患者に対する治療法はありません - 徐々に障害が増加しています (Murray 2006)。

現在、MS の診断と定期的なフォローアップに利用できるバイオマーカーはありません。 CSF 中のオリゴクローナル IgG - 診断の確認に役立ち、侵襲的な処置を必要とし、疾患の活動性や治療への反応とは相関しません。 MS の活動と治療への反応を監視できる MRI は、日常的に使用するには費用がかかりすぎる (Link and Huang 2006; Murray 2006)。

Technion の Hossam Haick 博士は、呼気サンプルから病気を診断するための電子鼻を開発しました。 Haick 博士の以前の研究では、金ナノ粒子に基づく電子鼻が、肺がん (Peng, Tisch et al. 2009) および腎臓病 (Haick, Hakim et al. 2009) の安価で非侵襲的な診断ツールの基礎を形成できることが示されました。 ）。

研究仮説 CNS 炎症および/または神経変性および/または CNS 修復のバイオマーカーは、MS 患者の呼気サンプル中の「電子鼻」によって検出できます。

目的

以下のバイオマーカーの同定:

1. 中枢神経系の炎症と中枢神経系の自己免疫
2. 神経変性

3. 中枢神経系の修復

   • これは、疾患 (対コントロール)、疾患活動性 (進行性の疾患経過の予測、再発の予測、悪性 MS と良性 MS の予測) のマーカーとして機能する可能性があります。治療に対する反応（ステロイド、免疫療法または神経保護剤）。

作業計画の概要:

いくつかのグループを臨床的に評価する:

• ステロイド治療の７、３０および９０日前対後の急性再発のＭＳ患者－急性炎症プロセスおよびステロイド治療の効果の指標を評価するため。
• 再発性 MS 患者 対 進行性 MS 患者 対 健常者、ならびに MS 以外の神経疾患および自己免疫疾患に罹患している患者を含むコントロール - 炎症性指標と神経変性指標を評価します。
• 免疫療法またはステロイドに対する良好な応答者と低い応答者である MS 患者。

ブレスコレクション：

ボランティアの肺胞呼吸は、外因性の呼気揮発性バイオマーカーから内因性を効果的に分離し、鼻の同調を除外する「オフライン」メソッドを使用して収集されます。 ボランティア 1 人あたり 750 ml の呼気サンプルが入ったバッグ 2 つを、不活性マイラー バッグ (Eco Medics、デュエルテン、スイス) に収集します。 蒸気サンプリングは、収集装置への呼気サンプリングを 15 ～ 20 分間延長して行い、このプロセス中に数回停止しました。 呼気サンプリングの最初の 3 分間は、上気道の空気が汚染されている可能性があるため破棄されます。 その後の深層空気は、テスト目的で保持されます。 サンプルは、ボランティアの口に導入され、収集バッグに接続されたチューブで収集されます。 すべての参加者は、この研究に対する署名済みのインフォームド コンセントを提供します。この研究は、承認後、カーメル医療センターのヘルシンキ委員会および人間での実験の監督のためのテクニオンの委員会のガイドラインに従って実行されます。

呼気サンプルの化学分析:

呼気サンプルの化学分析には、ガスクロマトグラフィー/質量分析 (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation、日本) と熱脱着システム (TD20; Shimadzu Corporation、日本) を組み合わせて使用​​します。 Tenax® TA 吸着管 (Sigma Aldrich Ltd.) は、呼気サンプル中の VOC を事前に濃縮するために使用されます。 カスタムメイドのポンプ システムを使用して、マイラー バッグからの呼気サンプルを TA チューブから 100 ml/分の流速で吸引し、分析する前に熱脱着 (TD) チューブ (Sigma Aldrich Ltd.) に移します。 GC-MSによる。 次のオーブン温度プロファイルが設定されました。(a) 35°C で 10 分間。 (b) 150°C まで 4°C/min の昇温。 (c) 300°C まで 10°C/min で昇温。 (d) 300°C で 15 分間。 ５％フェニルメチルシロキサン（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、厚さ０．５μｍ）を含むＳＬＢ－５ｍｓキャピラリーカラム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌｔｄ．）を使用する。 スプリットレス注入モードは、30 cm/秒の一定の線速度および 0.70 ml/分のカラム流量で 2 分間使用されます。 VOC の分子構造は、各実行中に標準キャリブレーション ガスとして 10 ppm イソブチレン (Calgaz、ケンブリッジ、メリーランド、米国) を使用して、標準モジュラー セットによって決定されます。 GC-MS クロマトグラム分析は、GCMS ソリューション バージョン 2.53SU1 ポストラン分析プログラム (島津製作所) を使用して実現され、国立標準技術研究所 (NIST) 化合物ライブラリ (Gaithersburg, MD 20899-1070, USA) を採用しています。

センシング測定:

呼気サンプルと検出器の間の相互作用により、揮発性有機化合物が検知材料の有機部分に吸着します。この吸着の結果は電気信号 (抵抗) に変換され、マクロ世界 (画面など) に送信されます。デバイスの）同じフィルムに見られる（半）導電性材料を介して。 結果は、コンピューターの画面に表示されます。

カスタム LabView (National Instruments) プログラムによって制御される自動システムを使用して、センシング測定を実行します。 センサーは、Agilent 34980A 多機能スイッチを使用して、同じ露出チャンバーで同時にテストされます。 IEEE 488 バスによって制御される Stanford Research System SR830 DSP ロックイン アンプを使用して、AC 電圧信号 (1 kHz で 0.2 V) を供給し、対応する電流 (研究対象のデバイスで <10μA) を測定します。 この設定により、0.01% という小さなコンダクタンスの正規化された変化を測定できます。 センサー抵抗は、実験中に継続的に取得されました。 センシング実験は、後続の露出サイクルを使用して継続的に実行されました (SOI、セクション 2 を参照)。

データ分析：

特徴抽出。 VOC 分析では、各センサー応答から 3 つのパラメーターが抽出されます。 (ii) 露出 (S2) の終了時のセンサー抵抗の正規化された変化。 （ｉｉｉ）応答曲線下の面積（Ｓ３）。 S1 と S2 は、露出前のセンサー抵抗の値に関して計算されます。 呼気分析では、各センサー応答 (コントロール VOC または呼気サンプルの各リリースのいずれか) から 2 つのパラメーターが抽出されます。 （ｉｉ）露出の途中でのセンサ抵抗の正規化された変化（Ｓ５）。 S4 と S5 は、露出前のセンサー抵抗の値に関して計算されます。 呼気サンプルからの VOC に対する応答に関連する情報のみをセンサー応答から保持するために、補正および較正プロセスがこれらのパラメーターに事後的に適用されます。 次に、同じサンプルへの 2 回の連続暴露で得られたパラメータの平均値を計算します。