Nanoteknik för detektion av multipel skleros jämfört med autoimmuna och neurologiska sjukdomar genom utandningsprov

MS är den vanligaste kroniska neurologiska sjukdomen som drabbar unga vuxna och debuterar vanligtvis i åldern 20-40 år. Kvinnor drabbas 3-4 gånger mer än män. Det är en komplex multifaktoriell sjukdom, med bakomliggande både genetiska och miljömässiga faktorer. Olika populationer har olika känslighet (Compston och Coles 2008).

Sjukdomen kännetecknas av 2 huvudfenotyper: skovförlöpande eller progressivt förlopp. Klinisk funktionsnedsättning beror på förstörelse av CNS myelin (främst oligodendrocyter) på grund av tre processer (Franklin 2002; Franklin och Ffrench-Constant 2008; Frischer, Bramow et al. 2009):

1. Inflammation - immunceller med avvikande aktivitet invaderar hjärnan och ryggmärgen och orsakar förstörelse av CNS myelin (en process som kallas demyelinisering och sekundär neurodegeneration - axonal och neuronal förlust)
2. Primär neurodegeneration (axonal och neuronal förlust) - utan framträdande inflammation

3. Reparation - de inflammatoriska och neurodegenerativa processerna följs av ett försök från CNS att reparera - men denna partiella och ofullständiga reparation är ofta grunden för kvarvarande underskott och funktionshinder (Chandran, Hunt et al. 2008).

   • Det akuta MS-relapset (presenteras som förlamning, synförlust, etc.) - anses bero på en avvikande akut immunaktivering och inflammatorisk process i CNS.
   • Den kroniskt ackumulerande funktionsnedsättningen - anses bero på den neurodegenerativa processen.

Reparationsprocesser noteras främst efter det akuta återfallet - och återhämtningen av funktionen kan vara spontan. Men vid svåra skov finns det ibland behov av STEROIDBEHANDLING (Tischner och Reichardt 2007).

Efter den ökade förståelsen av sjukdomen har nya immunterapier utvecklats (COPAXON /; Interferon -beta ) under de senaste 10-15 åren för långtidsbehandling. Dessa kan dock dämpa sjukdomen (minska antalet skov per år) men botar den inte. Dessutom är de fördelaktiga för endast ~40 % av patienterna med återfall - förlöpande. För närvarande finns det inga behandlingar för patienter med den progressiva sjukdomen - som har gradvis ökad funktionsnedsättning (Murray 2006).

För närvarande finns det inga biomarkörer tillgängliga för diagnos och rutinmässig uppföljning av MS. Oligoklonal IgG i CSF - som hjälper till att bekräfta diagnosen, kräver en invasiv procedur och är inte korrelerad med sjukdomsaktivitet eller svar på terapi; och MRT, som möjliggör övervakning av MS-aktivitet och svar på behandling är för dyrt för rutinmässig användning (Link och Huang 2006; Murray 2006).

Dr Hossam Haick från Technion, utvecklade en elektronisk näsa för diagnos av sjukdomar via utandningsprover. Dr Haicks tidigare studier har visat att en elektronisk näsa baserad på guldnanopartiklar kan utgöra grunden för ett billigt och icke-invasivt diagnostiskt verktyg för lungcancer (Peng, Tisch et al. 2009) och njursjukdomar (Haick, Hakim et al. 2009) ).

Forskningshypotes Biomarkörer för CNS-inflammation och/eller neurodegeneration och/eller CNS-reparation kan detekteras av den "elektroniska näsan" i utandningsprover från personer med MS.

Mål

Identifiering av biomarkörer för:

1. CNS-inflammation och CNS-autoimmunitet
2. Neurodegeneration

3. CNS reparation

   • som kan fungera som markörer för: sjukdom (mot kontroller), sjukdomsaktivitet (förutsäga aggressivt sjukdomsförlopp, förutsäga återfall; förutsäga malign vs benign MS); svar på terapi (steroider, immunterapier eller neuroprotektiva medel).

Arbetsplansöversikt:

Utvärdera några grupper kliniskt:

• MS-patienter vid akut återfall före - vs- efter 7 , 30 och 90 dagars steroidbehandling - för att bedöma indikatorer på den akuta inflammatoriska processen och på effekterna av steroidbehandling.
• Återfallande MS-patienter vs progressiva MS-patienter vs kontroller som inkluderar friska individer såväl som patienter som lider av andra neurologiska och autoimmuna sjukdomar än MS - för att bedöma inflammatoriska vs neurodegenerativa indikatorer.
• MS-patienter som är bra kontra dåliga - svarar på immunterapi eller steroider.

ANDNINGSkollektion:

Alveolär andedräkt från de frivilliga samlas in med hjälp av en "offline"-metod som effektivt separerar de endogena från de exogena andedräkts flyktiga biomarkörerna och utesluter den nasala inneslutningen. Två påsar med 750 ml utandningsprov per frivillig samlas i inerta Mylar-påsar (Eco Medics, Duerten, Schweiz). Ångprovtagning utfördes genom förlängd utandningsprovtagning i uppsamlingsapparaten under 15-20 minuter, med flera stopp under denna process. De första tre minuterna av utandningsprovtagning kasseras på grund av eventuell kontaminering av den övre andningsluften. Den efterföljande djupa luften hålls kvar för teständamål. Proverna samlas in med ett rör som fördes in i volontärens mun och kopplades till uppsamlingspåsen. Alla deltagare ger ett undertecknat informerat samtycke till denna studie, som utförs efter godkännande och enligt riktlinjerna från Helsingforskommittén vid Carmel Medical Center och Technions kommitté för övervakning av experiment på människor.

KEMISK ANALYS AV ANDNINGSPROVEN:

Gaskromatografi/masspektrometri (GCMS-QP2010; Shimadzu Corporation, Japan), kombinerat med ett termiskt desorptionssystem (TD20; Shimadzu Corporation, Japan), används för kemisk analys av utandningsproverna. Ett Tenax® TA-adsorbentrör (Sigma Aldrich Ltd.) används för att förkoncentrera VOC i utandningsproverna. Med hjälp av ett skräddarsytt pumpsystem sugs utandningsproverna från Mylar-påsarna upp genom TA-röret med 100 ml/min flöde, och överförs sedan till ett termisk desorptionsrör (Sigma Aldrich Ltd.) innan de analyseras av GC-MS. Följande ugnstemperaturprofil inställdes: (a) 10 min vid 35°C; (b) 4°C/min ramp till 150°C; (c) 10°C/min ramp till 300°C; och (d) 15 min vid 300°C. En SLB-5ms kapillärkolonn (Sigma Aldrich Ltd.) med 5 % fenylmetylsiloxan (30 m längd, 0,25 mm inre diameter och 0,5 μm tjocklek) används. Det splitfria injektionsläget används i 2 minuter, vid 30 cm/sekund konstant linjär hastighet och 0,70 ml/min kolonnflöde. VOC:s molekylära strukturer bestäms via standardmoduluppsättningen, med användning av 10 ppm isobuten (Calgaz, Cambridge, Maryland, USA) som standardkalibreringsgas under varje körning. GC-MS kromatogramanalys realiseras med hjälp av GCMS-lösningar version 2.53SU1 efterkörda analysprogram (Shimadzu Corporation), med hjälp av National Institute of Standards and Technology (NIST) föreningars bibliotek (Gaithersburg, MD 20899-1070, USA).

AVKÄNNINGSMÅT:

Vid interaktion mellan utandningsproverna och detektorn adsorberas de flyktiga organiska föreningarna i den organiska delen av avkänningsmaterialet. Resultatet av denna adsorption översätts till en elektrisk signal (motstånd) som överförs till makrovärlden (t.ex. skärmen) av enheten) genom det (halv)ledande material som finns i samma film. Resultaten presenteras sedan på datorskärmen.

Ett automatiserat system som styrs av ett anpassat LabView (National Instruments)-program används för att utföra avkänningsmätningarna. Sensorerna testas samtidigt, i samma exponeringskammare, med en Agilent 34980A multifunktionsbrytare. En låsningsförstärkare från Stanford Research System SR830 DSP som styrs av en IEEE 488-buss används för att mata växelspänningssignalen (0,2 V vid 1 kHz) och för att mäta motsvarande ström (<10μA i de studerade enheterna). Denna inställning gör det möjligt att mäta normaliserade förändringar i konduktans så små som 0,01 %. Sensormotstånd erhölls kontinuerligt under experimenten. Avkänningsexperiment utfördes kontinuerligt med efterföljande exponeringscykler (se SOI, avsnitt 2).

DATAANALYS:

Har extraktion. För VOC-analys extraheras tre parametrar från varje sensorsvar: (i) den normaliserade förändringen av sensorresistans i mitten av exponeringen (S1); (ii) den normaliserade förändringen av sensorresistans vid slutet av exponeringen (S2); och (iii) arean under svarskurvan (S3). S1 och S2 beräknas med hänsyn till värdet på sensorresistansen före exponeringen. För utandningsanalys extraheras två parametrar från varje sensorsvar (antingen till kontroll VOC eller till varje frisläppande av utandningsprov): (i) den normaliserade förändringen av sensorernas motstånd strax efter exponeringen (S4); och (ii) den normaliserade förändringen av sensorernas motstånd i mitten av exponeringen (S5). S4 och S5 beräknas med hänsyn till värdet på sensormotståndet före exponeringen. En kompensations- och kalibreringsprocess tillämpas i efterhand på dessa parametrar för att från sensorsvar endast behålla den information som är relaterad till deras svar på VOC från utandningsproverna. Medelvärdena för de parametrar som erhållits under de två på varandra följande exponeringarna för samma prov beräknas sedan.