Použití autologní stromální vaskulární frakce odvozené z tukové tkáně k léčbě osteoartrózy kolena

Metody:

Tuková sklizeň. Bez použití perorální nebo parenterální sedace byl standardní zvlhčovací roztok (1 litr Ringerova laktátu, 50 miligramů 1% lidokainu a 1 cm3 1:1000 epinefrinu) podán pomocí malých řezů vytvořených špičkou čepele skalpelu č. 11 v břiše. nebo bok za použití standardní víceotvorové infuzní kanyly. K infuzi roztoku do hlubokých a povrchových tukových kompartmentů byla použita technika super-wet plus (2 objemy zvlhčovacího roztoku na 1 objem navrhovaného odsátého tuku). Pro maximální vazokonstrikční účinek epinefrinu bylo povoleno dvacet minut. Tuk byl odebrán pomocí standardní metody odsávání asistované liposukce (SAL) s 3mm kanylou při přibližně 0,5 - 0,7 atmosféry vakua, nasátím přibližně 200-300 cm3 lipoaspirátu do sterilní nádoby na zpracování tkání (GID SVF-1, Lousiville, CO) pro každé koleno, které má být ošetřeno.

Způsob zpracování tukové tkáně. Lipoaspirát byl sklizen a zpracován až do vytvoření SVF v jediném GID SVF-1 sterilním zařízení na jedno použití. Jednotka GID SVF-1 obsahuje mycí mechanismus, síťový filtr a odstředivku ve stejném zařízení. Po sklizni byl lipoaspirát třikrát promyt 37C laktátovým Ringerovým roztokem s 20 mg Cipro a 5 000 jednotkami heparinu na litr a tekutá část byla odstraněna pomocí systému síťových filtrů, přičemž uvnitř nádobky zůstala suchá tuková hmota. Nádoba byla zvážena, aby se určilo množství suché tukové hmoty dostupné pro další zpracování. Promytá tuková hmota byla disagregována pomocí kolagenázy typu I (Worthington, Lakewood, NJ) v koncentraci 200 CDU/ml celkového katalytického objemu, kde celkový katalytický objem je objem tukové tkáně plus stejný objem 37C laktátového Ringerova roztoku. Kolagenáza byla injikována do nádobky přes sterilní .22 mikronový filtr (Millex-MP, Millipore, Cork, Irsko). Zařízení s tukovou hmotou, pufrem a kolagenázou bylo poté umístěno do inkubované třepačky na 40 minut při 38 °C při 150 otáčkách za minutu, viz obrázek 1. Po disagregaci byl přidán roztok lidského albuminu, aby se dosáhlo koncentrace 2,5 % a zastavila se jakákoli další aktivita kolagenázy. Zařízení bylo poté odstřeďováno při 800 g po dobu 10 minut. Supernatant, včetně všech plovoucích buněk a zbytků a vodné fáze, byl odstraněn pomocí portu na horní straně zařízení a zlikvidován. Peleta SVF na dně byla resuspendována v 10 ml sterilního LR přístupného přes centrální port na zařízení pomocí 14G 5,5palcové spinální jehly (Abbocath-T, Hospira, Sligo, Irsko). Vzorek 0,5 ml resuspenze byl odebrán do 1,5 cm3 Eppendorfovy zkumavky pro použití pro počítání buněk a test. Resuspendované buňky SVF byly koncentrovány do 3 ml dávky za použití sterilní 15 ml zkumavky Falcon při 400 g po dobu 4 minut.

Metoda počítání SVF. Počet buněk SVF a životaschopnost byly hodnoceny pomocí systému obrazové cytometrie ADAM MC (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). ADAM MC používá barvení propidium jodidem k počítání životaschopných a neživotaschopných jaderných buněk. 100 ul alikvot testovaného vzorku byl zředěn v poměru 1:5 (1 díl vzorku na 5 dílů sterilního LR), aby se vzorek upravil v rámci provozních limitů ADAM MC. Byla aplikována rozdílová barviva a alikvoty byly vloženy do kazety na jedno použití, která se používá se zařízením ADAM. Výsledky z počítacího zařízení ADAM poskytují koncentraci buněk SVF v injekční stříkačce pro resuspenzi a procento životaschopnosti. Celkový objem resuspenze v injekční stříkačce byl vynásoben koncentrací, aby se získal celkový počet resuspendovaných mononukleárních buněk (žádné tukové buňky, žádné červené krvinky a žádné fragmenty zahrnuté v procesu počítání).

Metoda injekce a vedení obrazu. Pacient byl umístěn do polohy na zádech a oblast nad laterální suprapatellární oblastí kolena byla připravena obvyklým sterilním způsobem s použitím roztoku jódu (1% Jodophor) a následně 70% roztoku isopropylalkoholu. Toto umístění bylo použito z důvodu snadného přístupu do intraartikulárního prostoru a zamezení injekce do tukového polštáře kolena. Pacientovi nebyla podána žádná sedace ani léky proti bolesti. Lokální anestetikum ethylchlorid byl nastříkán na laterální koleno, dokud se barva kůže nezměnila na bílou. Lidokainové lokální anestetikum bylo injikováno pomocí jehly 25 gauge ke znecitlivění kůže a podkožních tkání. Pomocí ultrazvukového systému M-Turbo Sonosite byl identifikován kloubní prostor a pod živým ultrazvukovým vedením bylo koleno aspirováno pomocí 18 gauge/1,5 palcová jehla, pokud byly k dispozici tekutiny pro odsávání. Poté byly všechny 3 cc pufrovaného roztoku SVF pomalu injikovány do intraartikulárního prostoru stejným 18 gauge/1,5 palcová jehla. Potom byla jehla odstraněna a na místo injekce byl aplikován přímý tlak po dobu přibližně deseti (10) sekund. Hemostáza po injekci byla potvrzena a poté bylo místo vpichu vyčištěno alkoholovým tamponem a přelepeno sterilní náplastí. Pacient dostal berle a byl požádán, aby po dobu dvou (2) dnů nedržel koleno, které mu bylo injekčně podáno. Pacientovi bylo umožněno ohýbat a ohýbat koleno tak dlouho, dokud byl zachován stav bez zatížení.

Metody hodnocení bolesti a mobility. Hodnocení bolesti kolene bylo provedeno pomocí nástrojů PROMIS bolesti, ověřeného systému škálování bolesti vyvinutého za financování NIH. PROMIS (Pacient Reported Outcomes Measurement Information System) je systém pro měření pacientem hlášeného zdravotního stavu pro fyzickou, duševní a sociální pohodu, včetně tří měření bolesti (www.nihpromis.org). Nástroj PROMIS Intensity bolesti (3a) vyhodnocuje, jak moc člověka bolí. Nástroj PROMIS Pain Behavior (Banka 1.0) měří chování, které ostatním naznačuje, že jedinec pociťuje bolest. Nástroj PROMIS Pain Interference (Banka 1.0) měří důsledky bolesti na relevantní aspekty života člověka. Odpovědi pacientů jsou převedeny na číselné hodnoty ve validované škále. Odpovědi na každou otázku v nástroji pro bolest se pohybují od 1 do 5 (1=vůbec ne, 2=trochu, 3=poněkud, 4=docela málo, 5=velmi mnoho) a jsou sečteny přes počet otázek v bance, abyste vytvořili hrubé skóre. Hrubé skóre je převedeno na standardizované skóre pomocí metody iterativní odezvy s průměrem 50 a SD 10, na základě velkého vzorku obecné populace Spojených států. Validované škály bolesti PROMIS poskytují intervalová data a umožňují výpočet průměru a SD a použití t-testů významnosti. Údaje byly zaznamenány před operací (čas 0) a v kontrolních bodech po 2 týdnech, 4 týdnech, 6 týdnech a 12 týdnech.

Dále byli pacienti požádáni, aby odpověděli na dotazník bolesti a mobility s jednou otázkou o bolesti a jednou otázkou o mobilitě. V dotazníku byl pacient požádán, aby porovnal zvýšení/snížení bolesti a pohyblivosti ve srovnání s před operací pomocí škály ± 1-5, viz obrázek 2. Na této škále záporná čísla odpovídají klesající bolesti/mobilitě a kladná čísla odpovídají rostoucí bolest/mobilita. Tento dotazník poskytuje ordinální data a umožňuje výpočet mediánu a významnosti pomocí Wilcoxon Ranked Sums neparametrického testování.